苯胺-4-羟化酶(AH)试剂盒说明书
分光光度法 50管/24样
注 意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶,在外源物质代谢中具有重要作用,尤其是药物和毒物的代谢。AH在P450酶系中相当于CYP2E1亚型,CYP2E1不仅参与了药物的代谢,而且还能催化多种前致癌物和前毒物的活化过程。
苯胺-4-羟化酶(AH)试剂盒测定原理:
AH催化苯胺羟化后产生的4-氨基酚,进一步转变为酚-吲哚复合物,在630nm处有特征吸收峰;通过测定630nm吸光度增加速率,来计算AH活性。
自备仪器及用品:
可见分光光度计、普通离心机、超速离心机、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、双蒸水和冰。
试剂组成和配制:
试剂一:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入50 mL蒸馏水,充分溶解。
试剂二:液体×1瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入26 mL蒸馏水,充分溶解。
试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入13 mL蒸馏水,充分溶解。
试剂五:液体×1瓶,4℃保存。
试剂六:粉剂×1瓶(腐蚀性试剂),4℃避光保存。临用前加入26 mL蒸馏水,充分溶解。
试剂七:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入26 mL蒸馏水充分溶解。
标准液:液体×1瓶,10μmol/L,4℃避光保存。
粗酶液提取:
1、除去细胞核,线粒体等大分子物质:称约0.5g组织,加入1mL试剂一,冰上充分研磨,10 000g 4℃,离心30min,取上清液,转移到超速离心管中。
2、粗制微粒体: 100 000g 4℃,离心60min,弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质:向步骤2的沉淀中加1mL试剂一,盖紧后充分震荡溶解,100 000g离心30min,弃上清液。
4、最终微粒体:向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL,盖紧后充分震荡溶解,即粗酶液,待测。
苯胺-4-羟化酶(AH)试剂盒测定操作:
1. 分光光度计预热30 min,调节波长到630 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂三置于37℃水浴中预热30min。
3. 试剂五置于冰浴预冷30min。
4. 标准管:取1.5 mL EP管,加入500μL 标准液,500μL试剂六,500μL试剂七,混匀后室温静置30min,于630 nm测定光吸收,记为A标准管。
5. 对照管:取1支1.5 mL EP管,加入250μL粗酶液,500μL试剂三,250μL蒸馏水,混匀后37℃水浴中保温30min;再加入500μL试剂五,混匀后冰浴5min,11000rpm,4℃,离心10min;取500μL上清液,
加入1支新的1.5 mL EP管;再加入500μL试剂六,500μL试剂七,混匀后室温静置30min,于630 nm测定光吸收,记为A对照管。
6. 测定管:取1支1.5 mL EP管,加入250μL粗酶液,500μL试剂三,250μL试剂四,混匀后37℃水浴中保温30min;再加入500μL试剂五,混匀后冰浴5min,11000rpm,4℃,离心10min;取500μL上清液,加入1支新的1.5 mL EP管;再加入500μL试剂六,500μL试剂七,混匀后室温静置30min,于630 nm测定光吸收,记为A测定管。
苯胺-4-羟化酶(AH)试剂盒AH活性计算公式:
(1) 按照蛋白浓度计算:
活性单位定义:37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol 4-氨基酚为1个酶活单位。
AH活性(nmol/min/mg prot) = C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T
= 2×(A测定管-A对照管)÷A标准管÷Cpr
(2) 按照样本质量计算:
活性单位定义:37℃中每克样本每分钟催化产生1nmol 4-氨基酚为1个酶活单位。
AH活性(nmol/min/g 鲜重)= C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(W×V样)÷T
= 2×(A测定管-A对照管)÷A标准管÷W
C标准品:10μmol/L;V标准品:500μL=0.0005L;稀释倍数:V反总÷V上清液=1500μL÷500μL=3;Cpr:粗酶液蛋白质浓度,mg/mL,需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒;V样:加入反应体系中粗酶液体积,250μL=0.25 mL;W:样本质量,g;T:反应时间,30min。
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