羟脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
注 意 : 正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
HYP是机体胶原蛋白主要成分之一,胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等,因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。
羟脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)试剂盒测定原理:
样品经酸水解产生游离的HYP,进一步被氯胺T氧化,氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应,产生红色化合物,在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值,可计算HYP含量。
自备实验用品及仪器:
天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、无水乙醇、异丙醇、6mol/L盐酸和蒸馏水。
试剂组成和配制:
组织提取液:6mol/L盐酸,自备。浓盐酸:H2O(V/V)= 1:1,室温保存。
细胞提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体10mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂二:液体10mL×1瓶,4℃避光保存。
羟脯氨酸提取:
1. 组织:称取约0.5g样品于玻璃管,加入5mL的组织提取液,置于110℃烘箱,水解6至12小时,用提取液定容至5mL,12000g,25℃,离心20min,取上清待测。
2. 细胞:取500万个细胞,加入2mL的细胞提取液,于高压消毒器中15磅保持30min,自然降压后待测。
3. 血清游离羟脯氨酸提取:取0.2mL血清,加入1mL无水乙醇使蛋白质沉淀,8000g4℃离心5min。将上清倒入另一个EP管,氮吹或沸水浴将乙醇挥发干。冷却后再加入0.4mL50%异丙醇,充分溶解混匀待测。
测定操作表:
| 空白管 | 测定管 |
样本(µL) |
| 200 |
试剂一(µL) | 200 | 200 |
混匀,室温静置20min |
试剂二(µL) | 200 | 200 |
H2O(µL) | 600 | 400 |
混匀,60℃,20min,取出后25℃静置15 min,蒸馏水调零,1mL玻璃比色皿中检测560nm处吸光值。ΔA=A测定-A对照 |
羟脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)试剂盒羟脯氨酸含量计算公式:
标准曲线:y=64.875x+ 0.0251,R2=0.9991
(1)按组织计算
HYP含量(mg/g 鲜重)=(ΔA -0.0251)÷ 64.875×V反总÷(V样÷V样总×W)
= 0.385×(ΔA -0.0251)÷W
(2)按细胞计算
HYP含量(mg/104 cell)=(ΔA -0.0251)÷ 64.875×V反总÷V样×V样总÷细胞数量(万个)
= 0.154×(ΔA -0.0251)÷细胞数量(万个)
(3)按液体体积计算
HYP含量(mg/mL)=(ΔA -0.0251)÷ 64.875×V反总÷V样×2
= 0.154×(ΔA -0.0251)
V反总:反应总体积,1mL;V样:反应中样品体积,0.2mL;V样总:加入提取液体积, mL; W:样品质量,g;2,血清吹干后复溶的倍数。
注意事项:
1、 OD值大于0.8,样品适当稀释再测定,注意计算公式里乘以稀释倍数。
2、 试剂有一定的毒性,请操作时做好防护措施,防止吸入或与皮肤接触。
3、 最低检出限为3.8mg/L。
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