辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒

辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒说明书

                                                          分光光度法 50管/24样

注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP+和NADPH含量测定可以计算NADP（NADPH + NADP+ )含量和NADPH/NADP+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在PPP途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

测定原理：

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NADP+和NADPH。NADPH通过PMS的递氢作用，使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，570nm下检测吸光值，从而测定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原NADP+为NADPH，从而检测NADP+含量。

所需的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

酸性提取液：50mL×1瓶，4℃保存；

碱性提取液：50mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体15 mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1支，-20 ℃保存，用时加入4mL蒸馏水，混匀；用不完的试剂4℃保存一周；

试剂三：粉剂×1支，-20℃保存，用时加入4mL蒸馏水，混匀；用不完的试剂4℃保存一周；

试剂四：粉剂×1支，4 ℃保存，用时加入4mL蒸馏水，混匀；用不完的试剂4℃保存一周；

试剂五：液体1.8mL×1支，4 ℃保存；

试剂六：液体30mL×1瓶，4 ℃保存；

试剂七：液体50mL×1瓶，4 ℃保存。

NADP+和NADPH的提取：

1 血清（浆）中NADP+和NADPH的提取

NADP+的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议取约0.1mL血清（浆），加入1mL酸性提取液），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

NADPH的提取：按照血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议取约0.1mL血清（浆），加入1mL碱性提取液），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2组织中NADP+和NADPH的提取：

NADP+的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议取约0.1g组织，加入1mL酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

NADPH的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议取约0.1g组织，加入1mL碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3 细胞或细菌中NADP+和NADPH的提取：

NADP+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：酸性提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL酸性提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

NADPH的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：碱性提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL碱性提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。

2、加样表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加样）：

试剂名称(μL) 对照管 测定管

样本 50 50

试剂一 250 250

试剂二 75 75

试剂三 75 75

试剂四 75 75

试剂五 35 35

试剂六 500 混匀，室温避光静置20min

试剂六  500

充分混匀，静置5min后，20000g，25℃离心5min，弃上清，沉淀中加入：

试剂七 1000 1000

混匀，570nm下比色，读取对照吸光值A1和测定管吸光值A2，计算△A=A2-A1。

注意事项：

1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应20min后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、若NADP+测定中△A（A2-A1）≤0.0144，NADPH测定中△A（A2-A1）≤0.0259，说明样本中辅酶含量较

低，已低于检测限，可做如下调整：（1）将测定管避光静置时间20min延长到60min；（2）在提取阶段增加取样量，即取0.2g样本或0.2mL样本加入1mL提取液。

5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒50管保证测24个NADP+或NADPH。

NADP+和NADPH含量的计算：

（一）NADP+含量的计算

标准条件下的回归曲线为y = 0.197x + 0.0144，R2 = 0.9998；其中y为△A，x为NADP+浓度nmol/mL

1、血清（浆）中NADP+含量计算

NADP+含量(nmol/mL）=[ (△A -0.0144）÷0.197×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 101.5×(△A -0.0144）

2、组织、细菌或细胞中NADP+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADP+ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0144）÷0.197×V1) ]÷(V1×Cpr)= 5.1×(△A -0.0144）÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADP+ (nmol/g 鲜重）= [(△A -0.0144）÷0.197×V1)] ÷(W×V1÷V2)=10.2×(△A -0.0144）÷W

 (3)按细菌或细胞密度计算

NADP+ (nmol/104 cell）=[(△A -0.0144）÷0.197×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.02×(△A -0.0144）

（二）NADPH含量的计算

标准条件下的回归曲线为y = 1.2396x + 0.0259，R2 = 0.9977；其中y为△A，x为NADPH浓度nmol/mL

1、血清（浆）中NADPH含量计算

NADPH含量(nmol/mL）= [(△A -0.0259）÷1.2396×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 16.1× (△A -0.0259）

2、组织、细菌或细胞中NADPH含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷1.2396×V1)] ÷(V1×Cpr)= 0.8× (△A -0.0259）÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADPH (nmol/g 鲜重）=[(△A -0.0259）÷1.2396×V1) ]÷(W×V1÷V2)=1.6× (△A -0.0259）÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADPH (nmol/104 cell）=[(△A -0.0259）÷1.2396×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.003× (△A -0.0259）

V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆）体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。

注意：最低检测限为0.01nmol/mL或0.01nmol/g鲜重 或0.001nmol/mg prot