胞浆异柠檬酸脱氢酶(ICDHc)试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
注 意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
胞浆异柠檬酸脱氢酶(ICDHc)试剂盒测定意义:
ICDHc(EC 1.1.1.42)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化异柠檬酸脱氢脱羧生成 α-酮戊二酸,同时还原NADP+生成NADPH。ICDHc是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种NADPH重要来源,在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。
测定原理:
利用ICDHc催化NADP+还原成NADPH反应,在340 nm下测定NADPH浓度的增加。
所需的仪器和用品:
紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:60mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体50 mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1支,4℃保存;
试剂三:粉剂×1支,4℃保存;
试剂四:粉剂×1支,-20℃保存;
样本的前处理:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
胞浆异柠檬酸脱氢酶(ICDHc)试剂盒测定步骤:
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 将试剂二转移至试剂一中充分溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴中预热10min左右;用不完的试剂4℃保存。
3、 在试剂三中加入550μL蒸馏水充分溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴中预热10min左右;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
4、 在试剂四中加入550μL蒸馏水充分溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴中预热10min左右;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
5、 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 |
试剂一 | 750 |
试剂三 | 10 |
试剂四 | 10 |
样本 | 30 |
将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中,加样本的同时开始计时;混匀,在340nm波长下记录20s时的初始吸光度A1和2min20s时的吸光度A2,计算ΔA=A2-A1。
注意事项:
1、 若A2-A1大于0.5,需将酶液用提取液稀释,使A2-A1小于0.5,可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
2、 若A2-A1小于0.005,可延长反应时间到5min或10min。
ICDHc活力单位的计算:
1、血清(浆)ICDHc活力的计算:
单位的定义:每mL血清(浆)每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
ICDHc(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=2143×ΔA
2、组织、细菌或细胞中ICDHc活力的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
ICDHc(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=2143×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
ICDHc(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=2143×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
ICDHc(nmol/min /104)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=4.285×ΔA
V反总:反应体系总体积,8×10-4 L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.03 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
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