线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)活性测定试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)活性测定试剂盒测定意义:
ICDHm(EC 1.1.1.41)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,在三羧酸循中催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸,同时将NAD+ 还原为NADH,是三羧酸循环的限速酶之一,其催化的反应是细胞NADH主要来源之一。
测定原理:
ICDHm催化NAD+ 还原生成NADH,导致340nm处光吸收上升。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一:50mL×1瓶,-20℃保存;
试剂二:10mL×1瓶,-20℃保存;
试剂三:1mL×1支,-20℃保存;
试剂四:液体60mL×1瓶,4℃保存;
试剂五:粉剂×1支,4℃保存;
试剂六:粉剂×1支,-20℃保存;
试剂七:粉剂×1支,-20℃保存; 临用前加入3mL蒸馏水充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
工作液的配制:临用前把试剂五、试剂六转移到试剂四中混合溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
1、 称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆600g,4℃离心5min。
3、 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
4、 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的ICDHm(此步可选做)。
5、 在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体ICDHm活性测定。
线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)活性测定试剂盒测定步骤:
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm处,蒸馏水调零。
2、 工作液于 37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min。
3、 在1mL石英比色皿中依次加入60μL试剂七、80μL样本和1mL工作液,混匀,立即记录340nm处20s
时的吸光值A1和2min20s时的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。
ICDHm活性计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ICDHm活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样) ÷T=1145×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ICDHm(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=231.3×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ICDHm活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.463×ΔA
V反总:反应体系总体积,1.14×10-3 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.08 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
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