线粒体苹果酸脱氢酶（MDHm）试剂盒

线粒体苹果酸脱氢酶（MDHm）试剂盒说明书

                              分光光度法50管/48样

注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

线粒体苹果酸脱氢酶（MDHm）试剂盒测定意义：

MDH （EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物， 连接多条重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH，细菌中通常只含有NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。

测定原理：

MDHm催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm处光吸收下降。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1 mL石英比色皿和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：液体50mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：液体10mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：液体1mL×1支，-20℃保存；

试剂四、液体50 mL×1瓶，在4℃保存；

试剂五、粉剂×2支，-20℃保存；临用前加入300μL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂六、粉剂×2支，-20℃保存；临用前加入300μL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

线粒体苹果酸脱氢酶（MDHm）试剂盒样本测定的准备：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

① 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

② 将匀浆液于600g，4℃离心5min。

③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

④ 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的MDH（此步可选做）。

⑤ 在步骤④中的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体MDH测定。

测定步骤：

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 将试剂四在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。

3、 操作表：

将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中，混匀后立即在340 nm波长下记录初始吸光度A1和反应1min后的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。

计算公式中乘以相应稀释倍数。

MDHm活力单位的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V样÷V样总）÷T =1299×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷（2000×V样÷V样总）÷T=0.65×ΔA

V反总：反应体系总体积，8×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；2000：细胞或细菌总数，2000万。