硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase, TPX)活性测定试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
注 意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
TPX属于过氧化物酶家族,在体内主要通过还原过氧化氢和一些氢过氧化物来实现抗氧化作用,功能与GPX类似,也是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。TPX普遍存在于各种生物体内,如酵母、植物、动物、原生动物、寄生虫、细菌和古细菌,在进化上高度保守。TPX与细胞增殖、分化、细胞凋亡及肿瘤发生调控密切相关。TPX的主要功能包括细胞脱毒、抗氧化和调节由过氧化氢介导的信号转导和免疫反应。
硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase, TPX)活性测定试剂盒测定原理:
TPX催化H2O2氧化二硫苏糖醇(DTT),H2O2的吸收波长为240nm,通过测定240nm吸光度的下降速率,即可计算出TPX活性。
自备仪器和用品:
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水
试剂组成和配制:
试剂一:液体50mL×1瓶,室温保存。
试剂二:液体50mL×1瓶,- 20℃保存。
试剂三:液体5mL×1瓶,4℃。
粗酶液提取:
1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体:直接测定。
TPX测定操作:
1. 分光光度计预热30min,调节波长到240 nm,蒸馏水调零。
2.试剂二置于25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)水浴预热30 min。
3.取1mL石英比色皿,加入20 μ L上清液,900 μ L试剂二,80 μ L试剂三,迅速混匀后于240 nm测定10 s和130 s吸光度,记为A1和A2。
TPX活性计算公式:
(1) 按蛋白浓度计算
活性单位定义:25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分钟催化1nmol H2O2降解为1个酶活单位。
TPX活性(nmol/min /mg prot)=(A1-A2)÷ε÷d×V反总÷(Cpr×V样)÷T
=573×(A1-A2)÷Cpr
(2) 按样本质量计算
活性单位定义:25℃或者37℃中,每克样本每分钟催化1nmol H2O2降解为1个酶活单位。
TPX活性(nmol/min/g鲜重)=(A1-A2)÷ε÷d×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T
=573×(A1-A2)÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义:25℃或者37℃中,每104个细胞每分钟催化1nmol H2O2降解为1个酶活单位。
TPX活性(nmol/min/104 cell)=(A1-A2)÷ε÷d×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
=573×(A1-A2)÷细胞数量
(4)按液体体积计算
活性单位定义:25℃或者37℃中,每毫升液体每分钟催化1nmol H2O2降解为1个酶活单位。
TPX活性(nmol/min /mL)=(A1-A2)÷ε÷d×V反总÷V样÷T
=573×(A1-A2)
ε:H2O2的摩尔消光系数,43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积(L),1000 μ L=0.001 L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL);V样:加入反应体系中上清液体积(mL),20 μ L=0.02 mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W,
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