还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
GSH是细胞内最主要的抗氧化巯基物质,在抗氧化、蛋白质巯基保护和氨基酸跨膜运输等中具有重要作用。还原型与氧化型比值(GSH/GSSG)是细胞氧化还原状态的主要动态指标。因此,测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值,能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。
还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)试剂盒测定原理:
DTNB与GSH反应生成复合物,在412nm处有特征吸收峰;其吸光度与GSH含量成正比。
自备仪器和用品:
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体×1瓶,4℃保存。
试剂三:液体×1瓶,4℃避光保存。
粗酶液提取:
1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体:直接测定。
GSH测定操作:
1. 分光光度计预热30min,调节波长到412 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二置于25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)水浴中保温30min。
3. 空白管:取1mL玻璃比色皿,依次加入100μL蒸馏水,700μL试剂二,200μL试剂三,混匀静置2min后测定412 nm吸光度A1。
4. 测定管:取1mL玻璃比色皿,依次加入100μL上清液,700μL试剂二,200μL试剂三,混匀静置2min后测定412 nm吸光度A2。
注意:空白管只需要测定一次。
GSH含量计算公式:
GSH标准曲线公式:y=1.5 x(x为GSH浓度,μ mol /mL;y为吸光值)
GSH计算:
(1)按蛋白浓度计算
GSH(μ mol/ mg prot)=(A2-A1) ÷1.5×V样÷(V样×Cpr )=0.667×(A2-A1) ÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
GSH(μ mol/g鲜重)=(A2-A1) ÷1.5×V样÷(V样÷V样总×W)=0.667×(A2-A1) ÷W
(3)按细胞数量计算
GSH(μ mol /104 cell)=(A2-A1) ÷1.5×V样÷(V样÷V样总×细胞数量)=0.667×(A2-A1) ÷细胞数量
(4)按液体体积计算
GSH(μ mol/ mL)=(A2-A1) ÷1.5×V样÷V样 =0.667×(A2-A1)
V样总:上清液总体积,1 mL;V样:加入反应体系中上清液体积,100μL=0.1 mL;W:样品质量,g ;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL;
还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)试剂盒注意事项:
1. 试剂一中含有蛋白质沉淀剂,因此上清液不能用于蛋白浓度测定。
2. 最低检出限为0.01mmol/L。
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