羟甲基戊二酰辅酶A合成酶(HMGCS)试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
羟甲基戊二酰辅酶A合成酶(HMGCS)试剂盒测定意义:
羟甲基戊二酰辅酶A合成酶是甲羟戊酸代谢途径中的关键酶,催化乙酰CoA与乙酰乙酰CoA生成羟甲基戊二酰CoA。
测定原理:
HMGCS催化乙酰CoA与乙酰乙酰CoA生成羟甲基戊二酰CoA,同时产生CoASH,使DTNB转化为黄色的TNB,在412nm下有特征吸光值。
所需的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:60mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:粉剂×1瓶,-20℃避光保存;临用前加入7mL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂二:粉剂×1瓶,-20℃避光保存;临用前加入7mL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂三:15mL×1瓶,4℃避光保存。
样本测定的准备:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
羟甲基戊二酰辅酶A合成酶(HMGCS)试剂盒测定步骤:
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至412nm,蒸馏水调零。
2、 在1 mL玻璃比色皿中加入125μL试剂一、125μL试剂二和250μL试剂三,混匀,加入500μL样本上清,迅速混匀后记录412nm下初始吸光值A1和4min后的吸光值A2。计算ΔA=A2-A1。
HMGCS活性计算:
1、血清(浆)活性
单位定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。
HMGCS(nmol/min /mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样 ÷T=36.76×ΔA
2、组织、细菌或细胞HMGCS活性
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。
HMGCS(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=36.76×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义:每g组织每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。
HMGCS(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=36.76×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmolTNB为一个酶活力单位。
HMGCS(nmol/min /104 cel)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.074×ΔA
V反总:反应体系总体积,1×10-3 L;ε:TNB摩尔消光系数,1.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.5 mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,4 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。
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