线粒体柠檬酸（Mitochondrion citric acid, MCA）含量试剂盒说明书
分光光度法25管/24样
注 意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
线粒体柠檬酸（Mitochondrion citric acid, MCA）含量试剂盒测定意义：
CA是线粒体三羧酸循环的个中间产物，由柠檬酸合酶催化乙酰CoA与草酰乙酸合成，其含量是三羧酸循环强度的主要指标之一。
配合测定丙酮酸含量、丙酮酸脱氢酶活性、乙酰CoA含量、柠檬酸合酶活性和CA含量，其中（1）丙酮酸含量和丙酮酸脱氢酶活性变化可以反映糖酵解进行程度，（2）综合分析丙酮酸含量、丙酮酸脱氢酶活性和乙酰CoA含量变化可以反映脂肪酸β-氧化途径提供的乙酰CoA情况，（3）乙酰CoA含量、柠檬酸合酶活性和CA含量变化可以反映三羧酸循环进行状况。
测定原理：
CA在柠檬酸裂解酶的作用下，生成α-酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性条件下，α-酮酸进一步与苯肼反应，生成相应的α-酮酸苯腙；α-酮酸苯腙在330nm处有吸收峰，该波长下吸光度的变化程度可反映出CA的含量。
自备仪器和用品：
分光光度计、水浴锅、可调式移液枪、1mL石英比色皿、研钵和蒸馏水。
试剂组成和配制：
酸性提取液：液体25mL×1瓶，4℃保存。
碱性提取液：液体25mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体7.5mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体2.5mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入7.5mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存；
标准品：液体1mL×1支，10μmol/mL柠檬酸标准液，4℃保存。
线粒体柠檬酸（Mitochondrion citric acid, MCA）含量试剂盒线粒体中柠檬酸提取：
称0.05~0.1g样品（建议称0.1g样本），加入0.5mL酸性提取液，冰上充分研磨，600g/min 4℃离心5min；取上清至另一EP管中，11000g/min 4℃离心10min，弃上清（取300μL该上清液和300μL碱性提取液中和后可用于细胞质CA含量测定）；沉淀即线粒体，向沉淀中加入0.5mL酸性提取液，充分悬浮溶解，超声波破碎（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次），取此溶液300μL和300μL碱性提取液中和，混匀，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。
测定步骤：
1、分光光度计预热30 min以上，调节波长到330nm，蒸馏水调零。
2、试剂一、二和三37℃预热10min。
3、样本测定：
空白管和标准管通常只需要各做一个。
试剂名称(μL) | 空白管 | 标准管 | 测定管 |
试剂一 | 300 | 300 | 300 |
蒸馏水 | 300 |
|
|
标准液 |
| 300 |
|
样本 |
|
| 300 |
试剂二 | 100 | 100 | 100 |
试剂三 | 300 | 300 | 300 |
充分混匀，330nm立即测定初始吸光值A1和37℃孵育30min后的吸光值A2，ΔA=A2 –A1。
柠檬酸含量计算：
（1）按蛋白浓度计算
柠檬酸含量(μmol/mg prot)=[C标准管×(ΔA测定管－ΔA空白管)÷(ΔA标准管－ΔA空白管) ×V样]÷（V样÷Cpr）=10×(ΔA测定管－ΔA空白管)÷(ΔA标准管－ΔA空白管)÷Cpr
蛋白质含量需要另外测定。
（2）按样本鲜重计算
柠檬酸含量(μ mol/g鲜重)=[C标准管×(ΔA测定管－ΔA空白管)÷(ΔA标准管－ΔA空白管) ×V样]÷（W×V样÷V样总）=10×(ΔA测定管－ΔA空白管)÷(ΔA标准管－ΔA空白管)÷W
C标准管：标准液浓度，10μmol/mL； V样：加入反应体系中样本体积：0.3mL；V样总：加入提取液体积：1mL；Cpr：样品蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
注意：最低检测限为10nmol/mg prot或1μmol/g鲜重。
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