甲基柠檬酸合酶(metheyl-citrate synthase,MCS)试剂盒说明书
分光光度法10管/9样
注 意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测甲基柠檬酸合酶(metheyl-citrate synthase,MCS)试剂盒定意义:
MCS广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中,与柠檬酸合酶(CS)共同参与三羧酸循环的调节。
测定原理:
MCS催化丙酰CoA和草酰乙酸产生甲基柠檬酰辅酶A,进一步水解产生甲基柠檬酸;该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB,在 412nm处有特征吸光值。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水
试剂组成和配制:
试剂一:液体10mL×1瓶,-20℃保存;
试剂二:液体2mL×1瓶,-20℃保存;
试剂三:液体0.2mL×1支,-20℃保存;
试剂四:液体10mL×1瓶,4℃保存;
试剂五:粉剂×1支,4℃保存,临用前加入320μL无水乙醇;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂六:粉剂×1支,-20℃保存,临用前加入320μL蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂七:粉剂×1支,-20℃保存,临用前加入320μL蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
① 称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆600g,4℃离心5min。
③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
④ 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的CS(此步可选做)。
⑤ 在步骤④中的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体CS测定。
甲基柠檬酸合酶(metheyl-citrate synthase,MCS)试剂盒测定步骤:
1、分光光度计预热30min以上,调节波长至412nm,蒸馏水调零。
2、将试剂四、五、六和七在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min。
3、样本测定
试剂名称(μL) | 测定管 |
试剂四 | 780 |
试剂五 | 30 |
试剂六 | 30 |
样本 | 30 |
试剂七 | 30 |
将上述试剂按顺序加入1 mL玻璃比色皿中,加试剂七的同时开始计时,在412nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和反应2min后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。
MCS活性计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
MCS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1100×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
MCS(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=222.2×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
MCS(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.4444×ΔA
V反总:反应体系总体积,9×10-4 L;ε:TNB摩尔消光系数,1.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.03 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。
关键字: 甲基柠檬酸合酶(metheyl-citr;甲基柠檬酸合酶(metheyl-citr;
上海雅吉生物科技有限公司成立于2011年3月,是一家面向生命科学领域,提供科研类试剂、耗材、仪器、技术服务的生物企业。包括分子生物学、免疫学、微生物学、细胞学等 。旗下拥有 “雅吉生物”、“晶风生物”、“彩佑实业”、“GTX” 品牌。通过公司各部门员工的共同努力在行业内拥有较高知名度,深得新老客户厚爱,本着“优质、服务、信誉”的精神,坚持以优良的技术、优质的产品、良好的信誉为国内外广大用户提供优质生物产品和服务。
公司在重视产品质量的同时,也建立了一套集技术支持,物流售后服务等多部门联动服务体系,努力把我们方便、快捷、周到的服务提供给每一个客户,雅吉生物的试剂盒,在国内众多重点实验室广泛使用,深受广大科研人员好评,先后在权威杂志文章中被引用。
本公司郑重承诺:质量保证、供货及时、服务周到。