ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意 :正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)试剂盒测定意义:
ACL(EC4.1.3.8)是脂肪酸合成中的关键酶,其催化产生的乙酰辅酶A可用于脂肪酸合成和碳链延长、黄酮类物质合成、氨基酸合成等。
测定原理:
ACL在ATP和辅酶A存在的情况下催化柠檬酸裂解为乙酰辅酶A、草酰乙酸、腺苷二磷酸和磷酸盐。苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+,在340nm测定NADH减少速率,计算ACL活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水
试剂组成和配制:
提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体50mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存;
试剂三:液体5μL×1支,4℃保存;
样本的前处理:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
(1)工作液的配置,将试剂二和试剂三转移至试剂一中,充分混合溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;(注意:可取少量试剂一至试剂二和试剂三中,充分混匀溶解后转移至试剂一瓶中,重复2-3遍);用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
(2)在1mL石英比色皿中加入50μL样本和950μL工作液,混匀,立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)试剂盒ACL活性计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清(浆)ACL活力计算
单位定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
ACL(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=1608×ΔA
2、组织、细菌或细胞中ACL活力计算
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
ACL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
ACL(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=1608×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位定义:每1万个细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
ACL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=3.216×ΔA
V反总:反应体系总体积,1×10-3 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
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