N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosidase, NAG)试剂盒说明书
分光光度法50管/24样
注 意 :正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
乙酰辅N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosidase, NAG)试剂盒酶A(Acetyl-CoA)含量测定试剂盒测定意义:
NAG是溶酶体中的一种酸性水解酶,广泛存在于各种组织、体液和细胞中,以前列腺和肾近曲小管细胞内含量最高。NAG活性变化与机体某些病理状态密切相关。
测定原理:
NAG分解β-N-乙酰氨基葡萄糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算NAG活性。
自备用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前每瓶加入5mL蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂仍-20℃保存。
试剂二:液体15mL×1瓶,4℃保存。
试剂三:液体50mL×1瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
乙酰辅N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosidase, NAG)试剂盒酶A(Acetyl-CoA)含量测定试剂盒测定步骤:
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。
2、样本测定(在EP管中依次加入下列试剂):
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 200 |
|
蒸馏水 |
| 200 |
试剂二 | 250 | 250 |
样本 | 50 | 50 |
迅速混匀,放入37℃准确水浴30min
充分混匀,400nm处测定吸光值A,计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。
NAG活性计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、标准条件下测定的回归方程为y = 0.00543x +0.0083;x为标准品浓度(nmol/mL),y为吸光值。
2、血清(浆)NAG活力的计算
单位的定义:每mL血清(浆)每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
NAG活力(nmol /min/mL)= [(ΔA-0.0083) ÷0.00543×V反总]÷V样÷T =61.39×(ΔA-0.0083)
3、细胞、细菌和组织中NAG活力的计算
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
NAG活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0083) ÷0.00543×V反总]÷(V样×Cpr)÷T
=61.39×(ΔA-0.0083) ÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
NAG活性(nmol/min/g鲜重)= [(ΔA-0.0083) ÷0.00543×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T
=61.39×(ΔA-0.0083)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
NAG活性(nmol/min /104cell) =[(ΔA-0.0083) ÷0.00543×V反总]÷(500×V样÷V样总)÷T
=0.123×(ΔA-0.0083)
V反总:反应体系总体积,0.5mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g; 500:细胞或细菌总数,500万;T:反应时间,30min。
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