酸性磷酸酶(ACP)活性测定试剂盒说明书
分光光度法50管/24样
注 意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
酸性磷酸酶(ACP)活性测定试剂盒测定意义:
ACP在酸性条件下催化磷酸单酯水解称无机磷酸,常见于巨噬细胞的溶酶体内。ACP常用于前列腺癌的辅助诊断。
测定原理:
在酸性环境中,ACP催化对硝基苯磷酸二钠水解生成4-硝基苯酚,在405nm有特征光吸收;通过测定405nm吸光度增加速率,来计算ACP活性。
自备仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、分析天平、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰、可调式移液器和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体60mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体25mL×1瓶,4℃保存。
试剂三:液体25mL×1瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆,4℃、10000g离心10min,取上清液待测。
2. 细菌或细胞:按照细菌或细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 血液可直接测定,或者适当稀释后测定。
测定:
1. 分光光度计预热30 min,调节波长到405 nm。
2. 在 EP 管中加入下列试剂
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 10 | 10 |
试剂一 | 90 | 990 |
试剂二 | 900 |
|
30℃避光保温30 min |
试剂三 | 400 | 400 |
混匀,吸取 1 mL 加入玻璃比色皿中,405 nm 下测定各管吸光值。ΔA=A测定管-A对照管。
注意:每个测定管需做一个对照管。
ACP活性计算:
标准曲线 y = 14.6672x + 0.0179;R2 = 0.9996;x为标准品浓度(μmol/mL),y为吸光值ΔA。
1. 血液中ACP活性计算
活性单位定义:30℃中每毫升血液每分钟催化产生1μmol 4-硝基苯酚定义为1个酶活单位。
ACP活力(μmol/min/mL)=(ΔA-0.0179)÷14.6672 ×V反总÷T÷V样
= 0.2273 ×(ΔA-0.0179)
2. 组织、细菌或细胞中ACP活性计算
(1)按照蛋白浓度计算
活性单位定义:30℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1 μmol 4-硝基苯酚定义为1个酶活单位。
ACP活力(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0179)÷14.6672×V反总÷T÷(V样×Cpr)
=0.2273 ×(ΔA-0.0179)÷Cpr
(2)按照样本质量计算
活性单位定义:30℃中每克组织每分钟催化产生1 μ mol 4-硝基苯酚定义为1个酶活单位。
ACP活力 (μmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0179)÷14.6672×V反总÷T÷(W×V 样÷V 样总)
= 0.2273 ×(ΔA-0.0179)÷W
(3)按照细菌或细胞数量计算
活性单位定义:30℃中每104个细菌或细胞每分钟催化产生1 μ mol 4-硝基苯酚定义为1个酶活单位。
ACP活力 (μmol/min/104 cell)=(ΔA-0.0179)÷14.6672 ×V反总÷T ÷(细胞数量×V 样÷V 样总)
= 0.2273 ×(ΔA-0.0179)÷细胞数量
V反总:反应体系总体积(mL),1 mL; W :样品质量,g; V样:加入反应体系中样本体积(mL),0.01 mL;V样总:提取液体积,1 mL;T:反应时间(min),30 min;500:细胞或细菌总数,500万。
酸性磷酸酶(ACP)活性测定试剂盒注意事项:
ACP不稳定,尤其在37℃和pH大于7的条件下活力丧失快,因此酸性磷酸酶样品一般需当天准备;血清样品中,每毫升血清中加入10mg柠檬酸氢二钠或者5mg硫酸氢钠,使pH降至6.5以下,或5ml血清加入30%醋酸溶液2~3滴,置于4℃可保存1周。
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