羧酸酯酶(carboxylesterase,CarE)活性测定试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
羧酸酯酶(carboxylesterase,CarE)活性测定试剂盒说测定意义:
哺乳动物CarE,也称脂族酯酶(aliesterase),广泛分布于组织和器官,属于丝氨酸水解酶家族。CarE催化含酯键、酰胺键和硫酯键的内源性与外源性物质水解,但不能催化水解乙酰胆碱及其类似物。CarE参与脂质运输和代谢,并且与多种药物、环境毒物以及致癌物的解毒和代谢有关,有机磷农药可结合并且抑制CarE活性。
测定原理:
CarE能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯,固蓝显色;在450 nm光吸收增加速率,计算CarE活性。
自备仪器和用品:
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体50mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体30mL×2瓶, 4℃保存;
试剂三:粉剂×2支, 4℃保存,临用前取1支试剂三,加1.2ml无水乙醇充分溶解;
试剂四:粉剂×2支,-20℃保存,临用前取1支试剂四,加少量试剂二溶解;
工作液配制:临用前配制,向1瓶试剂二中,加入溶解后的试剂三和试剂四各1支,充分溶解,过滤,4℃避光保存,可用1周。
羧酸酯酶(carboxylesterase,CarE)活性测定试剂盒说样本的前处理:
1、细菌、细胞样品制备
收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每200万细菌或细胞加入400μL试剂一,超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30次);12000g 4℃离心30min,取上清液待测。
2、组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆;12000g 4℃离心30min,取上清液待测。
3、液体:直接测定。
测定步骤:
1. 分光光度计预热30min,调节波长到450 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二置于37℃水浴中预热30 min。
3. 空白管:取1mL玻璃比色皿,依次加入5μL蒸馏水和1000μL试剂二,迅速混匀,于450nm处测定3min内吸光值变化,第10s吸光值记为A1,第190s吸光值记为A2。△A空白管=A2-A1
4. 测定管:取1mL玻璃比色皿,依次加入5μL上清液和1000μL试剂二,迅速混匀,于450nm处测定3min内吸光值变化,第10s吸光值记为A3,第190s吸光值记为A4。△A测定管=A4-A3
注意:空白管只需测定一次。
CarE活性计算公式:
1 组织中CarE活性
(1) 按照蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白在37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加1定义为1个酶活单位。
CarE酶活(U/mg prot)= (△A测定管-△A空白管) ×V反总÷(Cpr×V样)÷T
= 67×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
Cpr:蛋白质浓度,mg/mL;V样:加入上清液体积,0.005 mL;T:反应时间,3min。V反总:1.005mL;蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
(2) 按照样品质量计算
单位的定义:每g组织在37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加1定义为1个酶活单位。
CarE酶活(U/g 鲜重)= (△A测定管-△A空白管) ×V反总×(V样总÷V样)÷W÷T
= 67×(△A测定管-△A空白管)÷W
V样总:上清液总体积,1 mL;V样:加入上清液体积(mL),0.005 mL;V反总:1.005mL;W:样品质量(g);T:反应时间(min),3min。
2 细菌或细胞中CarE活性
单位的定义:每1万个细菌或细胞在37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加1定义为1个酶活单位。
CarE酶活(U/104 cell)= (△A测定管-△A空白管) ×V反总×(V样总÷V样)÷细胞密度(104 cell/mL)÷T
= 67×(△A测定管-△A空白管)÷细胞密度(104 cell/mL)
V总:上清液总体积,1 mL;V样:加入上清液体积(mL),0.005 mL;V反总:1.005mL ;T:反应时间(min),3min。
3. 液体中CarE活性
单位的定义:每毫升样品在37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加1定义为1个酶活单位。
CarE酶活(U/mL )= (△A测定管-△A空白管) ×V反总÷V样÷T
= 67×(△A测定管-△A空白管)
V样总:上清液总体积,1 mL;V样:加入上清液体积(mL),0.005 mL;V反总:1.005mL;T:反应时间(min),3min。
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