丙酮酸脱羧酶（pyruvate decarboxylase,PDC）活性测定试剂盒

丙酮酸脱羧酶（pyruvate decarboxylase,PDC）活性测定试剂盒说明书

                                      分光光度法50管/48样

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

丙酮酸脱羧酶（pyruvate decarboxylase,PDC）活性测定试剂盒测定意义：

PDC主要存在于酵母中，是乙醇发酵的关键酶之一，催化丙酮酸脱羧生成乙醛。

测定原理：

PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛，添加乙醇脱氢酶（ADH）来进一步催化 NADH还原乙醛生成乙醇和NAD⁺；NADH在340 nm有吸收峰，而NAD⁺没有；通过测定340 nm光吸收下降速率，来计算PDC活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体36mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存。

试剂四：粉剂×1支，﹣20℃保存。

试剂五：液体60μL×1支，﹣20℃保存。

混合试剂：临用前配制，将试剂四和试剂五转移至试剂三中充分溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂六：液体5mL×1瓶，4℃保存。

丙酮酸脱羧酶（pyruvate decarboxylase,PDC）活性测定试剂盒粗酶液提取：

1、细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加入400μL试剂一，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，工作3s，间歇10s，工作35次），16000g 4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

2、组织处理：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，16000g 4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）等液体样品：直接检测。

PDC测定操作：

1. 分光光度计预热30min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于25℃水浴中预热30 min。

3. 空白管：依次在1mL石英比色皿中加入100μL蒸馏水、100μL混合试剂、700μL试剂二和100μL试剂六，迅速混匀后于340nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A1和A2。

4. 测定管：依次在1mL石英比色皿中加入100μL上清液、100μL混合试剂、700μL试剂二和100μL试剂六，迅速混匀后于340nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A3和A4。

注意：空白管只需测定一次。

PDC活性计算公式：

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×10⁹}÷(Cpr×V样) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：25℃中，每克组织每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (nmol/min /g鲜重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×10⁹}÷(W×V样÷V样总) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中，每10⁴个细胞每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (nmol/min/10⁴cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×10⁹}÷(细胞数量×V样÷V样总) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷细胞数量

（4）按血清（浆）体积计算

活性单位定义：25℃中，每毫升血清（浆）每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。PDC (nmol/min /mL) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×10⁹}÷V样÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V总：反应体系总体积，1mL=0.001 L，V样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL；Cpr：蛋白浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒；W：样本质量，g ；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1 min。