磷脂酶D( Phospholipases D,PLD )试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
磷脂酶D( Phospholipases D,PLD )试剂盒测定意义:
磷脂酶D(EC3.1.4.4)即磷脂酰胆碱水解酶,是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称,广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中,具有参与细胞脂质代谢、信号传导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。
测定原理:
磷脂酶D催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱,胆碱在胆碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢,过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉红色物质,在500nm处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器:
天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、恒温水浴锅,无水乙醇。
试剂组成和配制:
提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体55mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂二:液体8mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂三:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。临用前加3mL无水乙醇充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂四:液体35mL×1瓶,4℃避光保存。
标准品:液体1mL×1支,4℃避光保存。
酶液提取:
1. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于4℃,10000g离心5min,取全部上清于4℃、100000g离心30min,弃上清,取沉淀溶于1mL试剂一。
2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后于4℃,10000g离心5min,取全部上清于4℃、100000g离心30min,弃上清,取沉淀溶于1mL试剂一。
3. 血清:直接测定。
磷脂酶D( Phospholipases D,PLD )试剂盒测定操作:
| 空白管 | 标准管 | 测定管 |
试剂一(μL) | 100 |
|
|
试剂二(μL) | 150 | 150 | 150 |
标准品(μL) |
| 100 |
|
样品(μL) |
|
| 100 |
试剂三(μL) | 50 | 50 | 50 |
充分混匀,30℃反应30min,沸水浴10min,打开盖子,自然冷却5min。 |
试剂四(μL) | 700 | 700 | 700 |
30℃反应30min,于1mL玻璃比色皿,空白管调零,测定500nm处吸光值,分别记为A标准管和A测定管。 |
酶活计算公式:
1.按照蛋白浓度计算
酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位。
PLD活性(nmol/min/mg prot)=
×C标准÷Cpr÷T= 16.7 ×
÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活性定义:每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位。
PLD活性(nmol/min/g 鲜重)=
×C标准÷W÷T = 16.7×
÷W
3.按照细胞数量计算
酶活性定义:每104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位。
PLD活性(nmol/min/104 cell)=
×C标准÷细胞数量÷T = 16.7×
÷细胞数量
4.按照液体体积计算
酶活性定义:每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位。
PLD活性(nmol/min/mL)=
×C标准÷T=16.7×![](/Ueditor/themes/default/images/spacer.gif)
C标准:标准品浓度,500nmol/mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g/mL;T:反应时间,30min
注意事项:
1. 显色完成后,若有沉淀,于8000g,25℃离心5min后取上清测定。
2. 吸光值不宜超过1,否则用试剂一将酶液进行稀释,并在计算公式中乘以稀释倍数。
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