葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)试剂盒说明书
分光光度法50管/24样
注 意:正式测定前取2-3个预期差异较大的样本做预测定
葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)试剂盒测定意义:
GOD(EC 1.1.3.4)广泛存在于动物、和植物中,催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸,并产生H2O2,是生物体中产生活性氧的代谢途径之一。
测定原理:
GOD催化产生H2O2,过氧化物酶催化H2O2氧化4-氨基安替比林偶联酚,生成有色化合物,在500 nm有特征吸收峰,颜色深浅与GOD活性成线性关系。
试验中所需的仪器和设备:
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水
试剂的组成和配制:
提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存;
缓冲液:液体50mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入20mL缓冲液充分溶解待用;用不完的试剂4℃保存一个月;
试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入20mL缓冲液充分溶解待用;用不完的试剂4℃保存一个月;
样品测定的准备:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)试剂盒测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至500nm,蒸馏水调零。
2、 试剂一和试剂二的配制:参见试剂的组成和配制。
3、煮沸样本的准备:取500μL样本至新的EP管中,95℃水浴10min,冷却至室温后,8000g 4℃离心10min,取上清作为对照管的煮沸样本待测。
4、测定操作表
试剂(μL) | 对照管 | 测定管 |
样本 |
| 250 |
煮沸样本 | 250 |
|
试剂一 | 375 | 375 |
试剂二 | 375 | 375 |
混匀,35'C保温15min后,于500nm波长处读取吸光度。ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。
GOD活力单位的计算
1、标准条件下测定回归方程为y = 2.8348x - 0.0169;x为H2O2标准品浓度(μmol/mL),y为ΔA。
1、血清(浆)GOD活力的计算
单位定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1nmol H2O2为一个酶活力单位。
GOD(nmol/min/mL)= (ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反总÷V样÷T×1000=58.8×(ΔA+0.0169)
2、细菌、细胞或组织GOD活力的计算
(1)按蛋白浓度计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol H2O2为一个酶活力单位。
GOD(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反总÷(V样×Cpr) ×1000÷T
=58.8×(ΔA+0.0169)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义:每g组织每分钟催化产生1nmol H2O2为一个酶活力单位。
GOD(nmol/min/g鲜重)=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反总÷(W×V样÷V样总) ×1000÷T
=58.8×(ΔA+0.0169)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位定义:每一万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol H2O2为一个酶活力单位。
GOD(nmol/min/104 cell)=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反总÷(500×V样÷V样总) ×1000÷T
=0.118×(ΔA+0.0169)
V反总:反应体系总体积,0.625mL; V样:加入样本体积,0.25mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,15 min; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
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