技术指标
外观:白色至浅棕色无定型冻干粉末;蛋白纯度:≥90%;比活性≥100U/mg酶粉;过氧化氢酶:≤0.001%;蛋白酶≤0.001%;尿酸酶:≤0.01%;ATP酶:≤0.005%;甘油激酶:≤0.01%;葡萄糖氧化酶:≤0.01%;
酶学性质
来源:微生物,胆固醇酯酶;分类:EC3.1.1.13;分子量:61kDa(SDS-PAGE);等电点:5.15;Km值:5.8×10-5MCholesterollinoleate;抑制剂:Ag+;最适:pH5.0;最适温度:55;pH稳定性4.5-9.0(37℃℃,60min);热稳定性:50℃以下稳定(pH7.5,30min);稳定性:-20℃静置保存12个月保持90%以上活性;保护剂:胆酸钠以及BSA。
酶活定义:单位酶活定义为在下述条件下,每分钟催化生成1μmolH2O2所需的酶量。
试剂准备
试剂I:0.2M磷酸钾缓冲液,pH6.0。
试剂II:在2.0mL异丙醇中加入39mg胆固醇亚油酸酯,水浴轻微加热至完全溶解。加入约80mL72-74℃预热的1%GenapolX-80,72-74℃水浴并搅拌30min,溶液会先变澄清后变浑浊。用自来水冷却溶液至室温。加入0.6g胆酸钠,溶解后用1%GenapolX-80溶液定容至100mL。
试剂III:1kU/mLPOD。
试剂IV:50mMTOOS溶液。
试剂V:50mM4-AA溶液。
试剂VI:300U/mLCOX酶液。
酶稀释液:20mM磷酸钾缓冲液,pH6.0,含2mMMgCl2,0.5mMEDTA-Na2和0.2%BSA。
操作步骤
1.向3mL比色皿中加入2.75mL反应混合物。
2.加入0.1mL试剂VI,37℃温浴2min.
3.加入0.1mL待测酶液,混匀。
4.37℃反应,用分光光度计在555nm检测样品1min内的吸光度变化(ΔAs)
武汉瀚海新酶生物科技有限公司
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