质粒小量提取试剂盒

试剂盒内容

产品说明：

        本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的 DNA的原理特异性提取质粒DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。

       使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。溶液Ⅰ在使用前先加入 RNaseA(将试剂盒中提供的 RNaseA 全部加入)，混匀，置于 2-8℃保存。如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

操作步骤（仅供参考）：

1、取5 mL 细菌培养物，12000 rpm离心1 min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个2 mL 离心管中)。

2、向留有菌体沉淀的离心管中加入  250 μL  溶液Ⅰ(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意:如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。

3、向离心管中加入250 μL溶液Ⅱ，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意:混匀一定要温和以免污染细菌基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过5 min，以免质粒受到破坏。

4、向离心管中加入350 μL溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮沉淀。12000 rpm离心10 min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。注意:溶液Ⅲ加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

5、将上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱加入收集管中)，空温放置2 min，12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6、向吸附柱中加入500 μL漂洗液Ⅰ(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000 rpm离心1 min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

7、向吸附柱中加入700 μL漂洗液Ⅱ(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000 rpm离心1 min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

8、向吸附柱中加入700 μL漂洗液Ⅱ，12000 rpm 离心1 min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

9、12000 rpm离心2 min，将吸附柱敞口置于室温或50 ℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。

10、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200 μL经65℃水浴热的洗脱液，室温放置2 min，12000 rpm离心1 min。

11、为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置2 min，12000 rpm离心1 min。

注意事项：

1、使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊，如有混浊现象，可在 37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、漂洗液Ⅰ和漂洗液Ⅱ使用后应立即拧紧盖子。

2、洗脱缓冲液体积不应少于100μL，体积过小影响回收效率；洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率，DNA产物应保存在-20℃，以防 DNA 降解。

3、DNA浓度及纯度检测：得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA可用琼脂糖疑胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD₂₆₀处有显著吸收峰，OD₂₆₀值为1相当于大约50ug/mL双链DNA、40ug/mL单链DNA。OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响吸光值，但并不表示纯度低。