人脂肪干细胞无血清培养基（无酚红）
一、产品基本信息
产品名称 | Applied Cell ® 人脂肪干细胞无血清培养基（无酚红） |
货 号 | AC-1001042（PRF） |
规 格 | 基础培养基450mL，添加剂50mL |
运输保存条件 | 基础培养基2-8℃，添加剂-20℃至-80℃；混合后2-8℃ |
使用范围 | 脂肪组织来源的脂肪干细胞扩增与传代培养 |
保质期 | 12个月 |
二、产品简介
人脂肪干细胞无血清培养基是埃泽思生物（Applied Cell®）自主研发的一款无外源动物成分的人脂肪干细胞培养基。可应用于人脂肪组织来源的人脂肪干细胞的扩增与传代培养，并保持其多向分化潜能。本产品内毒素水平远低于中国药典标准，生产过程遵循ISO9001体系,并符合GMP指导原则。
人脂肪干细胞无血清培养基主要成分：氨基酸，维生素、无机盐、白蛋白，转铁蛋白、胰岛素、微量元素，细胞因子等。
三、产品特性
l 无外源动物蛋白成分，大大降低各类病毒、霉菌和支原体等的污染风险。
l 全程无血清生产，极大降低批次间差异。
l 培养过程无需包被培养板。
l 扩增效率高，24h左右增殖翻倍，节省培养时间。
l 内毒素<0.06EU/ml，远低于中国药典水平。
四、产品内容
组分 | 规格 | 数量 | 运输 |
人脂肪干细胞无血清基础培养基 | 450mL | 1瓶 | 冰袋 |
人脂肪干细胞无血清添加剂 | 50mL | 1瓶 | 干冰 |
五、相关产品
无血清细胞冻存液（治疗级）（Applied Cell®: Cat. no.AC-1001006）
人脐带间充质干细胞（Applied Cell®: Cat. no.AC-2001003）
人脂肪间充质干细胞（Applied Cell®: Cat. no.AC-2001004）
细胞消化液（Applied Cell®: Cat. no. AC-1001024 ）
六、实验准备
人脂肪干细胞无血清培养基配制
1. 37℃快速解冻人脂肪干细胞无血清添加剂，快速溶解时不易破坏添加剂中营养物质，时间大致为10min。待添加剂融化后摇匀，分装或直接按比例添加到基础培养基中，分装后添加剂立即储存于-20℃至-80℃，避免反复冻融 。
2. 将添加剂以10%比例加入到人脂肪干细胞无血清基础培养基中，混匀，即为人脂肪干细胞无血清培养基（AC-1001042PRF）。混合后培养基可在2-8℃ 稳定储存2-3周，不建议使用已配制超过3周的培养基。
3. 人脂肪干细胞无血清培养基可直接应用于人脂肪组织来源的脂肪干细胞扩增与传代培养。
七、操作方法(以下步骤皆应在无菌条件下操作)
人脂肪干细胞的分离方法
1. 清洗脂肪组织提取物
新鲜脂肪组织放入4℃预冷的脐带脂肪保存液（AC-1001016）中，并快速运输到实验室进行细胞分离，充分的清洗脂肪组织提取物，去掉大部分红细胞和淋巴细胞。
1.1. 将约10-20mL的脂肪组织提取物放到一个无菌50mL离心管中;
1.2. 静置一段时间直到脂肪组织与血液分层；
1.3. 用一个巴氏吸管移走血液；
1.4. 加入相同的体积的含有双抗的PBS，盖紧盖子；
1.5. 剧烈摇晃5-10S
1.6. 将50mL离心管放到台面上使脂肪组织飘在PBS上面。根据样品的不同，这大概需要1-5min。
1.7. 用一个巴氏吸管小心的去除PBS；
1.8. 重复以上的清洗步骤3次（步骤3.4-3.7）
1.9. 最后一次的清洗液体应是清澈的。如果液体仍是红色的，重复步骤3.4-3.7再次清洗。
2. 脂肪组织消化
用人脂肪干细胞分离液（AC-1001013）处理脂肪组织
2.1. 在处理开始前10min,37℃预热人类脂肪干细胞分离液；
2.2. 加入与清洗过的脂肪组织等体积的人类脂肪干细胞分离液至50mL离心管；
2.3. 剧烈旋转摇动50mL离心管5-10s
2.4. 放到37℃培养箱中摇动孵育1-2h，每15min人工剧烈摇晃5-10s
2.5. 处理结束后，处理后的脂肪组织应呈现粥样的形态，(如果消化1h后消化效果不完全，
延长消化时间到2h，具体根据消化程度确定）。
3. 分离基质血管部分
3.1. 将人脂肪干细胞分离液处理后的脂肪组织室温200g离心5min，脂肪组织出现分层，参考图1。
3.2. 用巴氏吸管吸掉上层漂浮的脂肪层和中间液体层。留5mL底部液体,将SVF团留在管底(吸液时要注意，细胞团是凝胶状的，贴附不牢，容易被吸掉)。
3.3. 用10mL 人脂肪干细胞无血清培养基（AC-1001042PRF）重悬细胞团；
3.4. 室温300 ×g离心5min；
3.5. 去掉上清，留5mL底部的基质细胞和人脂肪干细胞无血清培养基混合液；
3.6. 重复3.3-3.5步骤；
3.7. 室温300 ×g 离心5min；
4. 重悬SVF，接种
4.1. 用4mL 人脂肪干细胞无血清培养基重悬新鲜分离的细胞，并计数；
4.2. 将细胞接种到培养板或培养瓶中，接种的细胞密度为1×10 个，可接种到1个T25的培养瓶中或6孔板的2个孔中，轻轻摇动使细胞平均分布到培养瓶或培养皿表面，置于37℃，5% CO 的培养箱中培养；
4.3. 接种24h后，换液去除未贴壁的细胞；
4.4. 每天在显微镜下观察细胞；
4.5. 细胞通常需要3-5天变成纤维状细胞，并开始分裂；
4.6. 每2天换液，细胞通常在培养5-7天后达到80-90%汇合度；可以传代或冻存，此时的细胞为P0代；
5. 脂肪间充质干细胞传代
培养5-7天后细胞达到80-90%汇合度时（参考图2），可以予以传代或冻存。
5.1. 吸掉培养瓶或培养皿中的培养基，用PBS清洗一次，加入适量细胞消化液（AC-1001024）覆盖皿底，37℃孵育2-3min，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离皿/瓶底，停止消化。轻轻敲打皿边待细胞呈细沙状脱落时迅速加入2倍体积的人脂肪干细胞无血清培养基，用移液枪扇形吹打使细胞脱落下来，并轻轻吹打成单细胞，将细胞悬液收集到15mL离心管中。
注意：吹打时不能有气泡
5.2. 室温300×g 离心5min；
5.3. 弃上清，加入人类间充质干细胞培养基，重悬细胞，按照1:3-1:6的比例传代。也可以计数，接种密度为；
5.4. 2-3×10 /cm 。均匀铺在培养皿/瓶中，置于37℃，5%CO 条件下培养。
6. 加入与清洗过的脂肪组织等体积的人类脂肪干细胞分离液
hASC细胞传代培养
1. 在显微镜下观察细胞，当细胞融合度达到90%，即可传代。
2. 在超净台/安全柜中，吸掉原有培养基，加入PBS溶液清洗一次，加入细胞消化液（AC-1001024）使之完全覆盖皿/瓶底。
3. 室温孵育4-5分钟或37℃孵育2-4分钟，显微镜下观察大部分细胞脱离皿底即停止消化。
4. 加入消化液2倍体积的人脂肪干细胞无血清培养基，用移液器轻轻吹打瓶壁上未完全脱离的细胞，并轻轻吹打混匀，使细胞完全分散。
5. 将细胞悬液转移到15 mL离心管中，1200rpm离心3 min。
6. 弃上清，加入人脂肪干细胞无血清培养基，重悬细胞，计数。1：3-1：4比例传代，或按1-2x104 cells/cm2 传代，均匀铺在培养皿/瓶中，置于37℃，5%CO2 培养箱中培养。
注意：细胞传代所需的时间：2-4天。5代及之前的细胞，生长速度较快。5代以后的细胞，生长速度稍缓。
hASC细胞冻存
1. 细胞达到90%汇合度， 吸掉原有培养基，PBS清洗一次。
2. 加入细胞消化液（AC-1001024）使之完全覆盖皿/瓶底，室温孵育4-5min或37℃孵育2-4min分钟，显微镜下观察大部分细胞脱离皿底即停止消化。
3. 加入消化液2倍体积的人脂肪干细胞无血清培养基，用移液枪轻轻吹打瓶壁上未完全脱离的细胞，并轻轻吹打混匀，使细胞完全分散。
4. 将细胞悬液转移到15 mL离心管中，1200 rpm离心3 min，吸掉上清。
5. 加入适量无血清细胞冻存液（治疗级）（AC-1001006），调整细胞冻存密度在1×106 cells/mL左右，每支冻存管分装1.5-2ml。
6. 直接放入-80℃，24h后转入液氮中长期保存。
细胞形态图
八、质量控制
检验项目 Test Catagories | 参考数据 Reference Data |
外观 Physical Appearance | 无色液体 Colorless Liquid |
澄清度 Clarity | 澄清 Clear |
pH值 pH Value | 7.0-7.4 |
渗透压 Osmolality | 270-340 （mosm/KgH2O） |
细菌内毒素 Endotoxin | 小于0.06 EU/ml |
无菌 Sterility | 无菌 Sterility |
支原体 Mycoplasma | 0.11um过滤，支原体试验为阴性 The mycoplasma test was negative after 0.11um filtration |
细胞生长试验 Cell Growth Test | 细胞为梭形，呈指纹状或螺旋状生长 The cells are spindle - shaped, fingerlike or spiral |
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