T7 High Yield RNA Transcription Kit（T7高产量RNA转录试剂盒）

产品描述                                                                                
T7 High Yield Transcription Kit对体外转录体系进行了优化，能以带有T7启动子的线性化质粒、PCR产物或合成的DNA片段等为模板，在较短时间内通过体外转录反应获得大量RNA，操作简单便捷。
本试剂盒转录合成的RNA可用于体外翻译、显微注射、RNA保护实验、探针杂交、RNAi和RNA结构和功能研究等。试剂盒NTP是单独提供，便于根据自己需求，在底物中加入修饰的核苷酸，制备生物素或染料标记的RNA。
运输和保存
干冰运输，-20℃保存。
产品组分

产品用途
体外RNA合成
注意事项

1. 为了避免RNase污染，实验中请穿实验服，戴一次性手套和口罩，使用RNase-Free耗材。

2. 实验所用DNA模板建议先纯化，以避免RNase、蛋白及盐离子残留对反应体系的影响。

3. Transcription Buffer (10×)中含有亚精胺，在低温条件下会使DNA模板沉淀，需在室温条件下配制反应体系。

4. 如果需要合成标记的RNA，请自备相应的修饰NTP。如果需要合成加帽RNA，请自备帽结构或帽类似物。

模板制备
推荐使用以下几种类型的模板，模板可用TE缓冲液或RNase-free Water溶解。
1、质粒模板
带T7启动子的质粒可以作为转录模板，质粒的线性化程度和纯度会影响转录的产量及RNA的完整性。环状质粒由于没有有效的终止，会转录出不同长度的RNA产物，为了得到特定长度的RNA，质粒必须完全线性化，线性化的质粒请确保双链为平末端或5’端为突出结构。
注：

1. RNase、盐离子、蛋白等会对转录反应产生影响，为提高转录实验的稳定性，建议质粒线性化后进行纯化，再作为模板使用。

2. 为确保转录产物长度与预期一致，建议质粒酶切后切胶回收目的片段，以获得高纯度长度单一的线性化模板。

2、PCR产物模板
带T7启动子的PCR产物可以作为体外转录模板。PCR扩增模板时将T7启动子（TAATACGACTCACTATAGGG）加在非编码区的上游引物的5’端。PCR产物可直接作为模板，无需纯化，但纯化后可以获得更高产量的RNA。
注：

1. 扩增完需要通过琼脂糖凝胶电泳确定产物的特异性和产量。

2. 为了获得更多的RNA，建议对PCR产物纯化后作为模板。若电泳条带单一，可以使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物后作为模板。若条带不单一，建议对目的条带切胶回收，回收产物作为模板。

3、合成的DNA模板
合成的带有T7启动子的DNA片段也可以作为体外转录的模板。
实验流程

体外转录

1. 试剂解冻：将Transcription Buffer (10×)室温下解冻和放置。将试剂盒其他组分振荡混匀，短暂离心收集于管底，冰上储存备用。

2. 按下表比例配制反应体系。

注：
a、Transcription Buffer (10 ×)中含有亚精胺，在低温条件下会使DNA模板沉淀，因此，需在室温条件下配制反应体系。
b、若果进行多个反应，可以先混匀除模板和RNase Free Water以外的组分，分装到各个管里，再加入模板。
c、反应体系通常为20 μL，可以根据需要按比例放大或缩小体系。
d、对于长模板（>1000 bp），建议使用线性化质粒作为模板。
e、推荐每20 μL体系使用0.1-1 μg模板。

 3.混匀、离心、37℃反应2-3 h。
注：建议使用PCR仪孵育，避免体系蒸发对实验造成影响。
 4.(选做）向反应体系中加入1 μL Dnase I (1 U/μL)，37℃孵育15 min，消化DNA模板。
 5.合成的RNA经电泳分析后纯化，用RNase-free Water稀释至合适浓度，可用于下游实验。
产物纯化
1、酚/氯仿纯化
a、加入160 μl RNase-free Water将产物稀释至180 μl。
b、加入20 μl 3 M的醋酸钠（pH 5.2）到稀释后的产物中，用移液器充分混匀。
c、加入200 μl的酚/氯仿混合液（1：1）进行抽提，室温10000 rpm离心5 min，将上层溶液（水相）转移至新的RNase-free EP管中。
d、加入与水相等体积的氯仿抽提2次，收集上层水相。
e、加入2倍体积的无水乙醇并混匀，-20℃孵育至少30 min，4℃ 15000 rpm离心15 min。
f、弃上清并加入500 μl预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀，4℃ 15000 rpm离心，弃上清。
g、开盖干燥2 min，加入20-50 μl RNase-free Water或其他缓冲液溶解RNA沉淀。
h、-80℃保存。
2、氯化锂纯化
a、20 μL体系中分别加入30 μL RNase Free Water和30 μL Lithium Chloride Precipitation Solution (7.5 M)，使Lithium Chloride的终浓度在2.5-2.8 mM之间。
b、-20℃放置至少30 min（可以放置过夜）。
c、12000 rpm离心15 min，去上清，收集沉淀。
d、用预冷的70%乙醇洗2次，每洗一次，离心5 min，倒弃液体，收集沉淀。
e、晾干RNA，RNase-free Water溶解后检测。
3、柱纯化
柱纯化可以去除蛋白和游离核苷酸。
纯化前加入80 µl RNase Free Water将产物稀释至100 µl，再按柱纯化说明书进行纯化。
4、磁珠纯化
磁珠纯化可以去除蛋白和游离核苷酸。
按磁珠纯化说明书进行纯化。
RNA分析与定量
1、凝胶电泳分析：转录产物可以使用变性琼脂糖凝胶进行电泳分析，评估产物的长度、完整性以及产量。
2、紫外吸收法进行RNA定量：游离核苷酸会影响定量的准确性，采用此方法前请先进行RNA纯化。
3、染料法进行RNA定量：用RiboGreen染料进行RNA定量，游离核苷酸不会影响定量，可以对纯化或者未纯化的反应产物中的RNA进行准确定量。
常见问题及解决方案1、转录产物产量低 ①实验组模板中含有抑制反应的成分
建议：重新对模板进行纯化，确定模板量及其完整性。
②实验模板序列本身原因
建议：加大模板投入量；延长反应时间；换用其他启动子和RNA聚合酶进行转录。2、短片段转录产量低 转录产物小于0.3 kb时，可以通过延长反应时间（4 h-过夜反应）或增加模板量来提高RNA产量。
3、RNA产物片段与预期不符
（1）RNA产物片段小于预期
①模板序列中包含类似于T7 RNA聚合酶的终止序列。
建议：尝试不同的RNA聚合酶。
②模板中GC含量高形成高级结构。
建议：可以加入SSB蛋白，以提高转录效率，或者使用42℃进行转录会提高转录产物的产量。
③RNase污染。
建议：实验过程中戴口罩、戴一次性手套并注意更换手套。使用一次性无酶枪头、EP管。实验试剂使用前离心，避免试剂在瓶盖或管口导致污染，开盖要小心，避免污染。（2）RNA产物片段大于预期 ①若是以线性化质粒为模板，可能质粒模板没有完全线性化，或者有义链3'端为突出结构。质粒作为模板必须完全线性化，即使存在小量的未线性化模板，也可能产生大量的长片段RNA产物。
建议：重新线性化质粒，要确保线性化完全，并检查模板结构，确保有义链3'端不能是突出结构。
②RNA存在未完全变性的二级结构。
建议：使用变性胶来检测RNA产物。
4、产物电泳拖尾现象
①转录及纯化过程被RNase污染
建议：使用RNase-free的枪头和EP管，实验中所用试剂都为RNase-free，戴一次性乳胶手套。
②电泳过程中被RNase污染
建议：电泳缓冲液用RNase-free Water配制，电泳槽和制胶器具用RNase-free Water浸泡，缩短电泳时间。
③DNA模板被RNase污染。
建议：重新纯化模板DNA。


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