微囊藻毒素ELISA检测试剂盒

一、概要
   随着中国水体的富营养化程度逐渐加剧，蓝藻水华和赤潮的发生逐渐增加。80% 的蓝藻水华都可以检测出次生代谢产物---微囊藻毒素（microcystins，MCs），它对水体环境和人群健康的危害已成为全球关注的重大环境问题之一。微囊藻毒素为七肽单环肝毒素，结构中存在着环状结构和间隔双键，因而具有相当的稳定性，它能够强烈抑制蛋白磷酸酶的活性，当细胞破裂或衰老时毒素释放进入水中，同时它还是强烈的肝脏肿瘤促进剂。MC是一种单环七肽物质，具有明显的肝细胞毒性。由于多肽中两种可变氨基酸组成的不同，具有多种异构体。其中存在最普遍、含量最多的是MC-LR，MC-RR，MC-YR这3种微囊藻毒素。研究表明，MC-LR的急性毒性最强，MC-YR次之，MC-RR最弱。

二、原理
  本试剂盒采用间接竞争法。酶标板微孔中预包被微囊藻毒素抗原，样品中残留的微囊藻毒素与微孔板上的抗原竞争微囊藻毒素抗体，加入酶标二抗后，用TMB显色，吸光值与样品中微囊藻毒素含量成负相关。

三、试剂盒组成

1. 包被有抗原的96微孔板：1块（96 孔，12 条×8 孔）

2. 高浓度标准品100ng/mL：1 瓶× 1mL     

3. 标准品工作液：0、0.075、 0.225、 0.675、 2.0ng/mL                1 瓶× 1mL

4. 微囊藻毒素抗体： 1 瓶 × 8mL

5. 酶标二抗：1 瓶 × 15mL

6. 10× 浓缩洗涤液：1 瓶 × 50mL

7. 样本稀释液：1 瓶 × 50mL

8. 显色底物液（TMB）：1 瓶 ×17mL

9. 终止液：1 瓶 × 7mL

10. 试剂盒说明书

11. 质检报告                                      

四、需要的仪器、试剂
1）仪器   

1. 酶标仪450nm（iELisa全自动酶标仪或相当者）

2. 离心机

3. 微量移液器20μL～200μL，100μL～1000μL

4. 50mL离心管

5. 8道微量移液器

6. 酶标板振荡器

7. 天平：感量0.01g

五、样品处理
1. 水样品---饮用水、地表水

1. 直接吸取50μL澄清样品用于检测。

稀释倍数：1
2. 海水

1. 吸取100μL澄清样品与900μL样本稀释液，混匀；

2. 直接吸取50μL澄清样品用于检测。

稀释倍数：5 （由于海水存在基质效应问题，根据大量的数据支撑，稀释因子由10变更为5）

六、酶联免疫分析程序
1. 测定之前注意事项
1) 使用前将所有试剂平衡至室温（20-25℃）。
2) 使用后迅速将试剂放入2-8℃冷藏。
3) 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序的要点。
4) 所有孵育过程应避免阳光直射，并按要求用盖板覆盖住酶标板。
2. 溶液的配制
1) 洗涤液的配制：将浓缩洗涤液用去离子水稀释10倍后使用（1份浓缩洗涤液加9份蒸馏水）。
3. 测定程序
1) 将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶标板架，标准品和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔袋封好置2-8℃冷藏保存。
2) 分别吸取50μL 标准品和样品加至相应的微孔（双孔）中，然后各加入50μL微囊藻毒素抗体加盖，室温温育30分钟（每个标准和样品必须使用新的吸头）。
3) 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体，然后每孔加入250μL 稀释好的洗涤液洗涤，振荡后倒出孔中的液体，拍干；重复操作四次，洗板时每次间隔30秒，洗完后用力在吸水纸上拍干。
4) 加入100μL酶标二抗抗体加盖，室温温育30分钟（每个标准和样品必须使用新的吸头）。
5) 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体，然后每孔加入250μL 稀释好的洗涤液洗涤，振荡后倒出孔中的液体，拍干；重复操作四次，洗板时每次间隔30秒，洗完后用力在吸水纸上拍干。
6) 每孔加入100μL底物， 室温避光温育10分钟。
7) 每孔加入50μL终止液，混匀。
8) 置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸光度值（OD值），参比波长630nm。（iELisa全自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值）。
七、  结果判定
1. 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

以微囊藻毒素准品浓度值（ppb）为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。
2. 样品的实际浓度为读数结果乘以相应稀释倍数。
3. 如果测定值超出检测范围，样品提取溶液按一定的比例用稀释缓冲液进行稀释。
八、 注意事项
1. 室温低于20℃或试剂及标本未回到室温（20- 25℃）会导致数值偏低。
2. 在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3. 标准物质和显色液对光敏感，避免直接暴露在光线下。
4. 混合要均匀，洗板要彻底（包括加样品和标准液的时候都必需充分混合均匀）。
5. 反应停止液为强酸性物质，避免接触皮肤。
6. 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要稀释或搀杂使用不同生产厂家的试剂盒这样会引起灵敏度降低。
7. 试剂盒的储存条件是2-8℃，切勿冷冻。
九、检测方法灵敏度、准确度、精密度
1. 精密度:批内变异系数<10%（n=10），批间变异系数<25%(n=10)。
2. 灵敏度：0.075ng/mL。
3. 样本最低检测线：
饮用水、地表水........................................0.075ng/mL
海水          ..........................................0.75ng/mL
4. 准确度:
饮用水、地表水 .......................................90%±25%
海水 ........................................................ 90%±25%