探针法作为microRNA定量研究的金标准,具有高特异性、高灵敏度的优势。Biorab的TaqMan miRNA定量PCR试剂盒,采用特异性的正向miRNA引物和接头引物进行PCR扩增,检测荧光基团采用FAM标记的TaqMan探针。使用该试剂盒可以高特异性、高灵敏度的检测低至100个细胞的miRNA分子,并可区分相似度极高的miRNAs。Biorab的TaqMan miRNA定量PCR试剂盒多达一万余种,试剂盒编号为MTTxxxxx,每一个mircoRNA分子对应一个检测试剂盒(包含特异性的TaqMan探针、正向引物、反向引物、定量试剂)。 TaqMan microRNA定量PCR试剂盒原理图: 产品组成:
储存:请置于-20℃,可保存2年;避免反复冻融。 检测效果和应用实例: 1.高灵敏度(最高可到0.1fM级水平) 2.高特异性,有效区分单碱基差异 3.应用实例 内参基因可选择使用: 1.TaqMan RNU6B miRNA 定量 PCR 试剂盒(货号:MTT01501)适用于人、鼠等哺乳动物组织、细胞样品; 2.TaqMan hsa-miR16 miRNA 定量 PCR 试剂盒(货号:MTT01511)适用于来源于人、鼠全血样品。 操作方法: 1.配制反应体系根据机型选择步骤A或B 步骤A:需要添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的Real-Time PCR 仪,包括:ABI 7000/7300/7500/7900 等。按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系:
注意:cDNA 模板来自于 TaqMan miRNA 反转录产物。 步骤B:无需添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的Real-Time PCR 仪,包括:LightCycler(Roche); MyiQ 2、CFX96 Real-Time PCR(Bio-Rad);Line-Gene(杭州博日)等。按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系:
注意:cDNA 模板来自于 TaqMan miRNA 反转录产物。 2.进行 Real-Time PCR 反应通常采用两步法,程序如下:
收集信号采用FAM 染料通道,反应结束后确认 Real-Time PCR的cDNA 样品和 NTC 阴性对照的扩增曲线。
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