产品描述
全血直接PCR试剂盒(Animal Blood Direct PCR Kit)可以直接对全血样本进行PCR,无需DNA提取或样品处理,大大降低了污染风险,缩短了检测时间。
试剂盒中包含配方优化的2× Blood Master Mix,具有很强抑制物耐受性,人血的模板加入量可达45%,鼠血的可达20%,可以灵敏的扩增血液样本中基因组和外源目的DNA片段。2× Blood Master Mix包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分,扩增产物末端加A,适用于Hieff Clone™快速克隆试剂盒(货号:10907ES60/10908ES60)。
该试剂盒可用于直接扩增的血样类型包括:新鲜血液、4℃贮存血液、冷冻血液以及储存在Whatman 903®和FTA®商用卡上的干血渍,且兼容所有常规抗凝剂(EDTA、柠檬酸盐、肝素等)。适用样本来源包括人血、鼠血、鸡血、鸟血、牛血、狗血等。
产品组分
a)2× Blood Master Mix:包含Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等。
b)6× DNA Loading buffer:不含SDS。
运输和保存方法
冰袋运输。-20℃保存。避免反复冻融。
操作方法
1. PCR反应体系配制
注:使用前务必充分混匀,避免剧烈震荡产生过多气泡。
a)模板使用量:进行基因组上的目的片段检测,建议使用少量的血液量作为模板;检测血液样本中某种病毒或细菌等的目的片段,建议扩大PCR体系并使用较大量的血液模板。血液模板最多占PCR体系的45%(人血)、20%(鼠血)。若模板使用含有血液的采集卡,可截取直径1-4 mm的血点,直接加入20-50 μL PCR反应体系进行扩增。
b)引物浓度:通常引物终浓度为0.2 μM,也可以根据情况在0.1-0.5 μM之间进行调整。
c)反应体系:推荐使用20 μL或 50 μL,以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
d)体系配制:配制好PCR反应体系,置于涡旋仪上涡旋混匀,瞬时离心将反应液集于管底。
2. PCR反应条件设置
a)预变性:95℃,5 min可以让白细胞裂解,释放可用于PCR扩增的基因组DNA。请勿缩短时间或降低温度。
b)退火温度:退火温度设置为引物Tm值即可。然而,使用高的退火温度可以有效减少非特异性扩增,并提高全血模板的扩增效率。因此,如扩增产物特异性较差,可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板最适退火温度。
c)延伸时间:按30 sec/kb设定,如不足30 sec,设置30 sec即可。
d)扩增循环数:35个循环已可以扩增足量产物。太多的循环将会导致非特异性扩增增加。
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