一站式平末端克隆试剂盒

一站式平末端克隆试剂盒
产品及特点 本产品是一种能使 DNA 片段的末端平滑化、5’端的磷酸化、DNA 片段 和载体的连接等诸反应高效快速完成的试剂盒。它具有下列特点：
1. 适用范围包括：由高保真 DNA 聚合酶如 Pfu、Pwo、DeepVent 等扩增 而来的 PCR 产物；一些限制性内切酶如 EcoRV、SmaI 等酶切产生的 DNA 片段；粘端 DNA 用 DNA 聚合酶补平后的片段。
2. DNA 片段的末端平滑化反应和 5’端的磷酸化反应可在一个反应体系中同 时进行，反应时间只需 10 min。
3. 本试剂盒中还含有高效的 DNA 连接液，可在短时间内完成连接反应。
一站式平末端克隆试剂盒
规格及成分 成 份 编号 十孔盒包装
10×末端平滑化/磷酸化缓冲液 131126a 40 μL（红盖）
末端平滑化/磷酸化 Mix 131126b 20 μL（白盖）
连接反应溶液 131126c 120 μL（绿盖）
超纯水 100935 400 μL（黄盖）
使用手册 131126sc 1 份
一站式平末端克隆试剂盒运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。 自备试剂 DNA 片段等。
使用方法 一、用 PCR 反应液直接进行克隆时 :
Blunting Kination 反应
1. 在微量离心管中配制下列反应液。
试剂 使用量
PCR 反应液 2 μL
10×末端平滑化/磷酸化缓冲液 2 μL
末端平滑化/磷酸化 Mix 1 μL
超纯水 15 μL
2. 37℃反应 10 min。
3. 70℃热处理 5 min。
Ligation 反应
4. 取 3. 的溶液 5 μL 到另一个新的微量离心管中。
5. 加入 1 μL 经过去磷酸化处理的平滑末端载体 DNA（50-100 ng/μL），
混合均匀。
6. 加入 6 μL 的连接反应溶液（连接反应溶液请于冰中融解，使用前混匀。
应避免多次反复冻融。），混合。
7. 16℃反应 1 h。
8. 全量转化 100 μL 的感受态细胞。
注意：用电刺激法做细菌转化时，先用乙醇沉淀或苯酚抽提等方法置换
DNA 溶解缓冲液后再进行电转化；PCR 产物中混有非特异性 DNA 时，可
以通过琼脂糖凝胶电泳回收目的 DNA 片段；PCR 反应液最适用量 2 μL，
用量过多会降低反应效率。如需提高 DNA 用量请用乙醇沉淀法精制 DNA
片段后再进行反应。
二、用精制后的 DNA 片段进行克隆时 ：
Blunting Kination 反应
9. 在微量离心管中配制以下反应液。
试剂 使用量
DNA 片段 0.2-20 pmol
10×末端平滑化/磷酸化缓冲液 2 μL
末端平滑化/磷酸化 Mix 1 μL
超纯水 up to 20 μL
10. 37℃反应 10 min。
11. 70℃热处理 5 min。
Ligation 反应
12. 取 11. 的溶液 5 μL 到另一个新的微量离心管中。
13. 加入 1 μL 经过去磷酸化处理的平滑末端载体 DNA（50-100 ng/μL）混
合均匀。
14. 加入 6 μL 的连接反应溶液，混合。
15. 16℃反应 1 h。
16. 全量反应液用于转化 100 μL 的感受态细胞。
注意：用电刺激法做细菌转化时，先用苯酚抽提和乙醇沉淀等方法置换
DNA 溶解缓冲液后再进行电转化；插入 DNA 与载体 DNA 的摩尔数比应
为 2﹕1-10﹕1。