一管式双链cDNA合成试剂盒

一管式双链cDNA合成试剂盒

产品及特点 本产品是用于一管式双链 cDNA 合成的试剂盒。cDNA 一链合成的原理是以 Oligo dT 为通用引物的、MMLV 催化的逆转录反应。其原理如下：cDNA 第二链合成的原理是用 RNase H 使 RNA-DNA 杂合链中的 RNA产生切口，再用 DNA Polymerase I 通过切口平移(nick translation)反应进行 RNA 链取代合成 cDNA 第二链，其原理图如下：

本产品具有下列特点：

1. 即开即用，含有合成两条 cDNA 链的所有试剂。

2. 一管式进行，一链 cDNA 合成后不需要任何处理，直接进入第二链的合成。

3. 所得双链 cDNA 可以直接用于后续的常规 PCR、real-time PCR、cDNA 文库构建、抑制性差减杂交等。

4. 本试剂盒足够 10 次 80uL 体系的双链 cDNA 合成反应。
规格及成分 成份 编号 十孔盒包装
Oligo dT 引物（0.5ug/uL） 100814 10 uL（白盖）
cDNA 一链合成缓冲液 130308A 40 uL（紫色）
MMLV 逆转录酶 60905 10 uL（绿色）
5×cDNA 二链合成缓冲液 130308b 160 uL（红色）
20×cDNA 二链合成酶混合液 130308c 40 uL（蓝色）
0.2 M EDTA 溶液 130309 40 uL（黄色）
超纯水 100935 1 mL（本色）
使用手册 130308sc 1 份

运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂 mRNA 提取试剂盒
使用方法 一：mRNA 的制备

本试剂盒不提供 mRNA 提取试剂，用户需自备相关试剂。

二：双链 cDNA 的合成

1. 在一个干净的塑料离心管中，按下表设置 cDNA 合成反应：

成分 用量

自备样品 mRNA 4 uL（0.5-2ug）

Oligo dT 引物（0.5ug/uL） 1 uL

70℃ 2 分钟后室温放置 2 分钟，短暂离心

cDNA 一链合成缓冲液 4 uL

MMLV 逆转录酶 1 uL

轻柔吹打混匀后 42℃保温 90 分钟合成一链 cDNA

超纯水 48 uL

5×cDNA 二链合成缓冲液 16 uL

20×cDNA 二链合成酶混合液 4 uL

轻柔吹打混匀后，短暂离心，16℃保温 2 小时

如果需要将双链 cDNA 平末端化，则需加自备 T4 DNA 聚合酶

2 uL，轻柔吹打混匀后，16℃继续保温 30 分钟。如果不需要将cDNA 平末端化，则直接进入下一步。0.2M EDTA 溶液 4 uL

2. 电泳 5uL 检测 cDNA 质量。如果 cDNA 在 0.5-10Kb 的范围内呈模糊一片，则 cDNA 合格。如果没看见 cDNA 或有其他异常，需查找原因后再继续。

3. 所得 cDNA 可以直接用于后续的常规 PCR、real-time PCR、cDNA 文库构建、抑制性差减杂交等实验。