一管式双链cDNA合成试剂盒
产品及特点 本产品是用于一管式双链 cDNA 合成的试剂盒。cDNA 链合成的原理是以 Oligo dT 为通用引物的、MMLV 催化的逆转录反应。其原理如下:cDNA 第二链合成的原理是用 RNase H 使 RNA-DNA 杂合链中的 RNA产生切口,再用 DNA Polymerase I 通过切口平移(nick translation)反应进行 RNA 链取代合成 cDNA 第二链,其原理图如下:
本产品具有下列特点:
1. 即开即用,含有合成两条 cDNA 链的所有试剂。
2. 一管式进行,链 cDNA 合成后不需要任何处理,直接进入第二链的合成。
3. 所得双链 cDNA 可以直接用于后续的常规 PCR、real-time PCR、cDNA 文库构建、抑制性差减杂交等。
4. 本试剂盒足够 10 次 80uL 体系的双链 cDNA 合成反应。
一管式双链cDNA合成试剂盒
规格及成分 成份 编号 十孔盒包装
Oligo dT 引物(0.5ug/uL) 100814 10 uL(白盖)
cDNA 一链合成缓冲液 130308A 40 uL(紫色)
MMLV 逆转录酶 60905 10 uL(绿色)
5×cDNA 二链合成缓冲液 130308b 160 uL(红色)
20×cDNA 二链合成酶混合液 130308c 40 uL(蓝色)
0.2 M EDTA 溶液 130309 40 uL(黄色)
超纯水 100935 1 mL(本色)
使用手册 130308sc 1 份
一管式双链cDNA合成试剂盒运输及保存 低温运输,-20℃保存,有效期一年。
自备试剂 mRNA 提取试剂盒
使用方法 一:mRNA 的制备
本试剂盒不提供 mRNA 提取试剂,用户需自备相关试剂。
二:双链 cDNA 的合成
1. 在一个干净的塑料离心管中,按下表设置 cDNA 合成反应:
成分 用量
自备样品 mRNA 4 uL(0.5-2ug)
Oligo dT 引物(0.5ug/uL) 1 uL
70℃ 2 分钟后室温放置 2 分钟,短暂离心
cDNA 一链合成缓冲液 4 uL
MMLV 逆转录酶 1 uL
轻柔吹打混匀后 42℃保温 90 分钟合成链 cDNA
超纯水 48 uL
5×cDNA 二链合成缓冲液 16 uL
20×cDNA 二链合成酶混合液 4 uL
轻柔吹打混匀后,短暂离心,16℃保温 2 小时
如果需要将双链 cDNA 平末端化,则需加自备 T4 DNA 聚合酶
2 uL,轻柔吹打混匀后,16℃继续保温 30 分钟。如果不需要将cDNA 平末端化,则直接进入下一步。0.2M EDTA 溶液 4 uL
2. 电泳 5uL 检测 cDNA 质量。如果 cDNA 在 0.5-10Kb 的范围内呈模糊一片,则 cDNA 合格。如果没看见 cDNA 或有其他异常,需查找原因后再继续。
3. 所得 cDNA 可以直接用于后续的常规 PCR、real-time PCR、cDNA 文库构建、抑制性差减杂交等实验。
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