中文名称:MTT检测试剂盒 英文名称:MTT Assay Kit 产品规格:500次 MTT广泛用于检测细胞生长,其原理是MTT可以被活细胞线粒体内的脱氢酶还原生成深紫色的formazan结晶,而死细胞则无此活性。深紫色的formazan结晶被溶解后可以通过测定490nm波长的光吸收而测定出其浓度,并由此推测出细胞的活力,细胞增殖越旺盛,则吸光度越高;细胞毒性越大,则吸光度越低。其原理如下: 产品特点: 1.采用独特的Formazan溶解液,可以充分溶解formazan,减少误差。 2.背景低,灵敏度高,线性范围宽,重复性好。 3.本产品为足够500次(5个96孔细胞培养板)微孔板检测。 4.可用于生物活性因子活性检测、抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性测定等。 试剂盒组成:
储存条件:低温运输、-20℃保存(但溶液B也可以常温运输和保存),有效期一年。 使用方法: 下面操作是检测细胞毒性的试验,其他应用跟此类似或更简单(如生长曲线试验),操作步骤可以以此为基础稍作修改即可,故不再赘述。 ㈠、接种细胞 1.按常规胰酶消化法消化汇合的单层细胞,收集到含血清的培养基中。 2.200g离心5分钟收集细胞沉淀。 3.用培养基重悬细胞沉淀,制备成单细胞悬浮液并计数。 4.将细胞稀释到2.5×103个/mL~5×10个/mL之间(需要根据细胞的生长速度决定),如果不知道生长数度,一般可以稀释到1×10个/mL。 5.将足够量的细胞悬液转移到培养皿中(便于用排枪取样)。一个96孔板的MTT检测需要约20mL的细胞悬液。 6.用排枪在96孔板除的第2-11列各孔正中央加入200μL细胞悬液(对正常细胞)。如果是肿瘤细胞,则加入100μL肿瘤细胞悬液和100μL培养基(总体积为200μL)。注意:一定要把细胞加在孔的正中,否则细胞会聚集在孔的角落处,影响试验。 7.用排枪在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟细胞悬液等体积的培养基。第1 列各孔将作为+培养基-细胞+MTT对照(用于测OD时调零),第12列加培养基的作用是减少边缘效应对第11 列反应的影响。 8.按常规细胞培养方法在37℃和5% CO2条件下孵育1-3天,使细胞进入指数生长期。 ㈡、药物处理 9.用培养基将药物稀释到8个待测浓度(如果不知道待测浓度,则需要预试验确定),一般一种药物需要做3块平行板。 10.去除第2到第11列(共10列)各孔中的培养基(不要触动细胞),保留第1 列和第12列各孔中的培养基。 11.在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鲜培养基,这些孔将作为+培养基+细胞-药物的对照。 12.在第3到第10列(共8列)各孔中加入8个浓度梯度的待测药物,每列加入一个浓度的药物。 13.按常规方法把96孔板继续放在在37℃和5% CO2条件下孵育一定的时间,此段时间即为药物处理细胞的时间,由用户自己决定。 14.处理结束后去除第2 到第11列(共10列,均含细胞)所有孔中的培养基,并再加入100μL新鲜培养基。 15.每天换培养使细胞数量扩增2-3倍(所需时间随细胞不同而不同)。 ㈢、存活细胞计数 16.在生长末期,去除第1到第11列各孔中的培养基后,再加入100μL新鲜培养基和10μL溶液A(含MTT成分),用锡箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2条件下继续培养4-8小时。注意:溶液A在低温情况下会凝固,使用前请室温放置或20-25℃水浴至全部溶解,摇匀后使用。MTT有致癌性,一定要带手套操作。 17.小心吸弃孔内培养基(含溶液A)。由于培养基可能会影响光吸收,尽可能去除。 18.每孔加入100μL溶液B,置摇床上低速振荡10分钟,使MTT形成的formazan结晶物充分溶解。 19.由于产物不稳定,故需要立即在酶联免疫检测仪上选择490nm测定吸光度。 注意:用第1 列各孔(+培养基-细胞+MTT对照)调零。 20.计数同样处理的各次重复的平均值。 21.以药物浓度为横轴,以吸光度为纵轴绘制曲线。由于各处理吸光度绝对值差别很大,一般需将其转化成生长抑制率(以不加药物的第2和第11列各孔数据的平均数作为100%),这样便于计算出IC50,用于各种药物处理效果的比较。注意:如果测生长曲线,则以时间为横轴。正常生长曲线一般呈现S型,具有促进作用的则斜率加大。
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