背景[1-3]
LONG TAQ DNA聚合酶是由pfu DNA Polymerase和Taq DNA聚合酶按照一定的比例混合而成。两种酶协同作用实现了扩增效率、合成速度和延伸性能的完美统一，在长片段PCR反应中具有独特的优势，可以合成超长的DNA片段。另外，此酶具有比Taq DNA聚合酶约5倍的PCR可信度。该酶的大多数PCR产物3’端带碱基A，可以通过TA克隆法进行克隆。Long Taq DNA聚合酶是专门用于扩增长片段的嗜热DNA聚合酶，Long Taq DNA聚合酶的保真性是Taq DNA聚合酶的3倍，简单模板的扩增长度可达40kb。
特点[4-6]
在扩增复杂模板（如GC-rich或重复序列）时，LongTaq DNA聚合酶的扩增效率显著高于Taq DNA聚合酶，特别适合复杂模板的PCR扩增。扩增产物具有两种末端：平末端与3，-dA突出末端。配以专为长片段PCR优化的反应缓冲液，特别适合对长片段的扩增。LF-Taq扩增性能优异,能在短时间内完成高效的PCR扩增.用普通Taq DNA聚合酶的进行PCR反应延伸时间一般为1kb/min,快速DNA聚合酶为1kb/10-15 sec,进行8kb产物的PCR反应可在1小时内完成.LF-Taq对简单模板的扩增可达40kb,对复杂模板的扩增也可达20kb。
其特点如下：
1.为长片段扩增特别优化，使用常规PCR Buffer即可扩增8-10kb，使用超长Buffer扩增长度可达20-40kb。
2．反应速度快，聚合速度高达10-15sec/kb，可为科研人员节约多达70%的实验时间。
3．扩增效率高，同等条件下产量远高于普通Taq酶，在扩增片段时优势尤其明显。
4．比活性高，分子量小于普通Taq酶。在相同酶量下有更高的酶活性。
5．低背景，显著减少非特异性条带和引物二聚体。
6．高稳定性，耐热性能，Long-Taq酶的T1/2=2.5-3 hour（100℃），12 hour（95℃），普通Taq酶的T1/2=1.6 hour（95℃），特别适合对高GC含量的模板的扩增。
应用[7][8]
用于先天性长QT综合征的基因突变检测及常见基因型与表现型的相关性研究
先天性长QT综合征(long QT syndrome,LQTS)属于遗传性心律失常,是由于编码心肌细胞离子通道的基因异常所导致,也被称为“离子通道病”。LQTS患者具有QT间期延长和T波形态异常的心电图特征,临床表现为反复发作的晕厥和室性心律失常,尤其是尖端扭转性室性心动过速(Torsade de pointes,TdP)。根据不同基因把LQTS划分为13个亚型：KCNQ1(LQT1)、KCNH2(LQT2)、SCN5A(LQT3)、ANK2(LQT4)、KCNE1(LQT5)、KCNE2(LQT6)、KCNJ2(LQT7)、CACNA1C(LQT8)、CAV3(LQT9)、SCN4B(LQT10)、AKAP9(LQT11)、SCNA1(LQT12)和KCNJ5(LQT13)。这些致病基因通过错义突变、缺失/插入突变、移码突变和剪接突变等多种方式造成心肌离子通道功能异常。
采用常规苯酚-氯仿法提取外周血白细胞基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测提取产物并置于-20℃保存。参照Splawski和Syrris等的相关研究设计KCNQ1基因的17对引物、KCNE1基因的3对引物和KCNH2基因的19对引物,交由上海英潍捷基生物公司合成。采用聚合酶链反应(PCR)扩增三个基因的全部外显子。PCR反应体系如下：采用Platinum Long Taq反应体系共25uL,除了1uL模板DNA,其余24uL的Supermix组成为：10xPCR缓冲液2.5uL2.5mM dNTP混合液2uL,50mM MgCl2O.75uL,5uM上游及下游引物各1uL,Platinum Long Taq DNA聚合酶0.2uL,其余加入灭菌蒸馏水补足体积。上述反应体系的扩增条件为：94℃预变性5min,94℃变性30s,58℃退火45s及72℃延伸90s,经过35个循环后,再以72℃5min延伸,终末以4℃保存。PCR完成后采用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定,对于电泳结果不满意的,重新优化反应体系和反应条件,直至效果。
最后由上海英潍捷基生物公司采用3730XL型DNA测序仪对扩增产物直接测序。测序结果应用Chromas软件进行BLAST同源比较,如有碱基改变,则在NCBI的SNP数据库中查找,确定是否为已公布的变异位点,明确是否存在氨基酸序列改变。扩增家系成员该变异位点的相应外显子并进行基因检测分析。同时筛查100名正常对照成员。
参考文献
[1]Who Are the Long-QT Syndrome Patients Who Receive an Implantable Cardioverter-Defibrillator and What Happens to Them?:Data From the European Long-QT Syndrome Implantable Cardioverter-Defibrillator(LQTS ICD)Registry[J].Circulation.2010(13)
[2]Identification of a Kir3.4 Mutation in Congenital Long QT Syndrome[J].The American Journal of Human Genetics.2010(6)
[3]Active Cascade Screening in Primary Inherited Arrhythmia Syndromes[J].Nynke Hofman,Hanno L.Tan,Marielle Alders,Irene M.van Langen,Arthur A.M.Wilde.Journal of the American College of Cardiology.2010(23)
[4]Prevention of Torsade de Pointes in Hospital Settings[J].Barbara J.Drew,Michael J.Ackerman,Marjorie Funk,W.Brian Gibler,Paul Kligfield,Venu Menon,George J.Philippides,Dan M.Roden,Wojciech Zareba.Journal of the American College of Cardiology.2010(9)
[5]Risk of Fatal Arrhythmic Events in Long QT Syndrome Patients After Syncope[J].Christian Jons,Arthur J.Moss,Ilan Goldenberg,Judy Liu,Scott McNitt,Wojciech Zareba,Ming Qi,Jennifer L.Robinson.Journal of the American College of Cardiology.2010(8)
[6]Repolarization Abnormalities in the Newborn[J].Peter J Schwartz,Marco Stramba-Badiale.Journal of Cardiovascular Pharmacology.2010(6)
[7]Prevalence of the Congenital Long-QT Syndrome[J].Peter J.Schwartz,Marco Stramba-Badiale,Lia Crotti,Matteo Pedrazzini,Alessandra Besana,Giuliano Bosi,Fulvio Gabbarini,Karine Goulene,Roberto Insolia,Savina Mannarino,Fabio Mosca,Luigi Nespoli,Alessandro Rimini,Enrico Rosati,Patrizia Salice,Carla Spazzolini.Circulation.2009(18)
[8]李岩.先天性长QT综合征的基因突变检测及常见基因型与表现型的相关性研究[D].南方医科大学,2012.