背景[1-3]
anti-Cytochrome c抗体是一类可以特异性结合人Cytochrome c的多克隆抗体，主要用于检测人Cytochrome c的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多种免疫学实验。
检测原理：双抗体夹心法测定标本中人Cytochrome c水平。用纯化的人Cytochrome c抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人Cytochrome c，再与HRP标记的人Cytochrome c抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人Cytochrome c呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人Cytochrome c浓度。
Cytochrome c为分散的针状结晶，氧化型系花瓣状结晶，二者均易溶于水及酸性溶液，前者水溶液呈桃红色，后者呈深红色。对热都较稳定。而前者较后者更稳定些，分子量约11000-13000。
其作用原理为在酶存在的情况下，对组织的氧化、还原有迅速的促酶作用。通常外源性细胞色素C不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素C便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，能提高氧的利用。
临床上用于各种组织缺氧急救的辅助治疗，如一氧化碳中毒、催眠药中毒、氰化物中毒、新生儿窒息、严重休克期缺氧、脑血管意外、脑震荡后遗症、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难和各种心脏疾患引起的心肌缺氧的治疗。
应用[4][5]
用于Sirt3介导的COX乙酰化在氧化应激诱导细胞凋亡中的作用研究
多亚基的细胞色素c氧化酶(Cytochrome c oxidase,COX)是线粒体呼吸链复合物IV,在电子传递过程中发挥重要作用。与氧化应激密切相关的老年退行性疾病和缺血/再灌注的细胞凋亡过程中均发现COX活性降低。但是目前并不清楚细胞凋亡是否与COX乙酰化状态升高有关。
据此,将考察Sirt3与COX乙酰化水平的关系,并进一步探讨其在氧化应激诱导的细胞凋亡中的作用。首先,研究Sirt3对COX乙酰化水平影响。采用30 m M Sirtuin家族抑制剂—尼克酰胺(nicotinic acid amide,NAM)作用于小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)3 h后,免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)观察Sirt3蛋白表达和COX乙酰化水平变化。
结果发现Sirt3蛋白表达明显减少,COX乙酰化水平显著增加。利用50 n M、100 n M si RNA干扰Sirt3后,利用紫外分光光度计检测COX的活性,根据IP分析COX亚基的乙酰化水平改变,WB检测凋亡相关蛋白。
结果也显示COX活性明显受到抑制,且COX的各亚基中COX-1乙酰化水平特异性升高,其余各亚基乙酰化水平变化不明显。此外,Cyt c释放到胞浆中增加,Caspase 3被激活,引起NIH/3T3细胞凋亡。
参考文献
[1]Skeletal Muscle MnSOD,Mitochondrial Complex II,and SIRT3 Enzyme Activities Are Decreased in Maternal Obesity During Human Pregnancy and Gestational Diabetes Mellitus[J].Kristen E.Boyle,Sean A.Newsom,Rachel C.Janssen,Martha Lappas,Jacob E.Friedman.The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism.2013(10)
[2]Maintaining good hearing:Calorie restriction,Sirt3,and glutathione[J].Chul Han,Shinichi Someya.Experimental Gerontology.2013
[3]SIRT3 protects cardiomyocytes from oxidative stress-mediated cell death by activating NF-κB[J].Chun-Juan Chen,Yu-Cai Fu,Wei Yu,Wei Wang.Biochemical and Biophysical Research Communications.2012
[4]Exploring the entrance of proton pathways in cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans:Surface charge,buffer capacity and redox-dependent polarity changes at the internal surface[J].Kristina Kirchberg,Hartmut Michel,Ulrike Alexiev.BBA-Bioenergetics.2012
[5]曹玲芳.Sirt3介导的COX乙酰化在氧化应激诱导细胞凋亡中的作用研究[D].暨南大学,2015.