谷胱甘肽还原酶的制备

2020/9/24 9:27:24

背景及概述[1]

谷胱甘肽还原酶可以还原氧化型谷胱甘肽(GSSG)生成还原型谷胱甘肽(GSH)。谷胱甘肽还原酶在许多组织中都有分布,可以维持细胞内充足的还原型谷胱甘肽(GSH)水平,GSH可以清除自由基和一些有机过氧化物,或作为谷胱甘肽氧化酶(Glutathioneperoxidase)的底物来清除一些过氧化物。

嗜冷谷胱甘肽还原酶制备[2]

该嗜冷谷胱甘肽还原酶,(1)由2个相同的亚基构成,亚基的表观分子量为54.6kDa,总分子量为105kDa;(2)动力学参数表观米氏常数Km还原辅酶IINADPH、Km氧化型谷胱甘肽GSSG、Km还原辅酶INADH分别为23.3μmol/L、66.0μmol/L、83.8μmol/L;(3)最适pH为7.5,强碱性对其活性影响比较大;(4)最适温度为25℃,属于一种低温酶或嗜冷酶,在0℃还具有一定的活力;对高温具有不稳定性,与低温酶相同;活化能为3.7kJ/(mol·K),-78℃保藏是的保藏方法;(5)最适Mg2+为7.5mmol/L,Ca2+、Mg2+对其活性具有促进作用;(6)螯合剂EDTA乙二醇-双(2-氨基乙基)四乙酸等、重金属离子如Cd2+、Pb2+、Cu2+、Zn2+等不同程度地抑制其活力。制备方法如下:

酶液的初提:

谷胱甘肽还原酶纯化的操作均在4℃进行。将冷冻干燥的南极微藻称重,共20g,加石英砂和液氮研磨数次后,加入4倍约80ml的酶提取液(含0.1mol/LpH7.8的磷酸钾盐缓冲液,5mmol/L谷胱甘肽、1mmol/LEDTA、0.1mmol/LDDT、1%PVP聚乙烯吡咯烷酮),反复冻融3次,四层纱布过滤;含脂类较多时使用0.22μm滤膜抽滤除脂;然后以14000转/分钟的转速离心15分钟,除去不溶性淀粉,上清液再以11000转/分钟的转速离心15分钟,弃沉淀,保留上清液。上清液在酶提取液中透析2天,透析期间更换缓冲液数次。

硫酸铵沉淀:

将透析过的含谷胱甘肽还原酶的上清液,先用量筒量好体积,缓慢逐步加入硫酸铵至40%饱和度,在冰浴中进行,边加边搅拌。加完后用浓氨水调pH至7.0,再继续搅拌2小时,不要起泡;以12000转/分钟的转速离心20分钟,取上清液继续加入硫酸铵至90%饱和度,边加边搅拌,浓氨水调pH至6.0左右,置于冰箱中过夜;同样转速离心,将沉淀悬于40ml酶提取液,重复上面步骤再沉淀1次,最终沉淀溶于离子交换平衡缓冲液(缓冲液A,含50mmol/LpH7.8的磷酸钾盐缓冲液,5mmol/L谷胱甘肽、1mmol/LEDTA、0.1mmol/LDDT),且对缓冲液A透析2天。

离子交换层析:

填料用二乙基葡聚糖凝胶DEAESephadexA50;先用平衡缓冲液平衡;上样后,用平衡缓冲液洗涤,再用氯化钾梯度洗脱,分部收集。

亲和层析:

将离子交换的收集样在缓冲液C(50mmol/LpH7.8的磷酸钾盐缓冲液,含0.1mol/LKCl、1mmol/LEDTA、0.1mmol/LDDT)透析浓缩后,进行亲和层析。称取1.5g2’,5’-ADPSepharose4B溶胀后装柱,柱大小为0.9cm×5cm,用缓冲液C平衡过夜,上样总蛋白为1.5mg,用缓冲液C洗柱至吸光度OD280nm小于0.02为止。然后用含5mmol/L的NADP+的缓冲液C进行洗脱,流速为0.25ml/分钟,每1ml/管收集,分别测定蛋白质吸收值和谷胱甘肽还原酶相对活力。将具有酶活力的管收集在一起,并测定酶的相对活力、蛋白质含量和总体积。柱的再生用含0.5mol/L氯化钾KCl、pH8.5的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸Tris-HCl和含0.5mol/LKCl、pH4.5的乙酸钠缓冲液交替反复洗脱3次,每次洗脱约2-3倍柱体积。

凝胶过滤:

填料为葡聚糖凝胶SephadexG-200,上样后,用50mmol/LpH7.8的磷酸钾盐缓冲液洗脱,洗脱流速成为0.25ml/分钟,按2.5ml/管分部收集。

参考文献

[1][中国实用新型]CN201621160598.1一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒

[2][中国发明]CN200610124336.4一种嗜冷谷胱甘肽还原酶及其制备方法

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