背景[1-3]
人P53(P53)ELISA KIT采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。
原理:往预先包被捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
人P53蛋白结构图
操作步骤
实验开始前,各试剂均应平衡至室温(试剂不能直接在37℃溶解);试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量,如样品浓度过高时,应对样品进行稀释,以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围,计算时再乘以相应的稀释倍数。
1.加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl,余孔分别加标准品或待测样品100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。
2.弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl(在使用前一小时内配制),酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。
3.温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,大约400μl/每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
4.每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液)100μl,酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。
5.温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
6.依序每孔加底物溶液90μl,酶标板加上覆膜37℃避光显色(30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)。
7.依序每孔加终止溶液50μl,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后立即进行检测。
应用[4][5]
用于卵巢肿瘤组织中突变型p53表达与iNOS活性及二者相关性的研究
收集病理存档标本75例,其中因手术切除正常卵巢11例,卵巢良性肿瘤15例,恶性肿瘤49例,根据FIGO分期标准将卵巢恶性肿瘤分为:早中期(Ⅰ、Ⅱ期)20例,晚期(Ⅲ、Ⅳ期)29例;高分化者12例,中低分化者37例,标本均经4%甲醛固定,石蜡包埋,制成5μm厚切片。
实验方法采用免疫组织化学方法检测突变型p53、iNOS蛋白的表达情况,即用型SABC试剂盒、兔抗人p53多克隆抗体、兔抗人iNOS多克隆抗体由武汉博士德公司提供,切片脱蜡后,按SABC免疫组化试剂盒步骤进行。
阴性对照用PBS代替一抗,每张切片随机选取5个视野,得出每张切片iNOS、突变型p53阳性染色细胞百分率,根据阳性染色细胞率分为3级:m(-)整个切片未见阳性染色或阳性染色细胞数<10%;切阳性(十卜阳性染色细胞数占10%-40%;枯)强阳性(+十厂3 40%。
统计学分析采用卡方检验及等级秩和检验。结果1、免疫组织化学结果:iNOS/l例正常卵巢组织中阳性率为18.18%,15例卵巢良性肿瘤为20.00助,49例恶性肿瘤中为61.22%;突变型自3正常卵巢为9.09%,卵巢良性肿瘤为13.33%,卵巢恶性肿瘤为65.31%。经卡方检验,iNOS恶性组表达分别与正常卵巢、良性肿瘤组进行比较差异都有显著意义(P<0.05人突变型PS 3蛋白在恶性组表达分别与正常卵巢、良性肿瘤组进行比较差异都有显著意义对<0.01。
参考文献
[1] The CpG dinucleotide and human genetic disease[J].David N.Cooper,Hagop Youssoufian.Human Genetics.1988(2)
[2] Emerging strategies to overcome resistance to endocrine therapy for breast cancer[J].M.Firdos Ziauddin,Dong Hua,Shou-Ching Tang.Cancer and Metastasis Reviews.2014(2-3)
[3] Breast cancer in China[J].Lei Fan,Kathrin Strasser-Weippl,Jun-Jie Li,Jessica St Louis,Dianne M Finkelstein,Ke-Da Yu,Wan-Qing Chen,Zhi-Ming Shao,Paul E Goss.Lancet Oncology.2014(7)
[4] Nuclear Receptor Coactivators:Master Regulators of Human Health and Disease[J].Subhamoy Dasgupta,David M.Lonard,Bert W.O’Malley.Annual Review of Medicine.2014
[5]刘凛.卵巢肿瘤组织中突变型p53表达与iNOS活性及二者相关性的研究[D].中国医科大学,2003.