背景[1-3]
人P53(P53)ELISA KIT采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
原理：往预先包被捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
人P53蛋白结构图
操作步骤
实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。
1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。
3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。
4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。
5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。
6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。
7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。
应用[4][5]
用于卵巢肿瘤组织中突变型p53表达与iNOS活性及二者相关性的研究
收集病理存档标本75例，其中因手术切除正常卵巢11例，卵巢良性肿瘤15例，恶性肿瘤49例，根据FIGO分期标准将卵巢恶性肿瘤分为：早中期（Ⅰ、Ⅱ期）20例，晚期（Ⅲ、Ⅳ期）29例；高分化者12例，中低分化者37例，标本均经4％甲醛固定，石蜡包埋，制成5μm厚切片。
实验方法采用免疫组织化学方法检测突变型p53、iNOS蛋白的表达情况，即用型SABC试剂盒、兔抗人p53多克隆抗体、兔抗人iNOS多克隆抗体由武汉博士德公司提供，切片脱蜡后，按SABC免疫组化试剂盒步骤进行。
阴性对照用PBS代替一抗，每张切片随机选取5个视野，得出每张切片iNOS、突变型p53阳性染色细胞百分率，根据阳性染色细胞率分为3级：m（－）整个切片未见阳性染色或阳性染色细胞数＜10％；切阳性（十卜阳性染色细胞数占10％－40％；枯）强阳性(＋十厂3 40％。
统计学分析采用卡方检验及等级秩和检验。结果1、免疫组织化学结果：iNOS／l例正常卵巢组织中阳性率为18．18％，15例卵巢良性肿瘤为20．00助，49例恶性肿瘤中为61．22％；突变型自3正常卵巢为9．09％，卵巢良性肿瘤为13．33％，卵巢恶性肿瘤为65．31％。经卡方检验，iNOS恶性组表达分别与正常卵巢、良性肿瘤组进行比较差异都有显著意义(P＜0．05人突变型PS 3蛋白在恶性组表达分别与正常卵巢、良性肿瘤组进行比较差异都有显著意义对＜0．01。
参考文献
[1] The CpG dinucleotide and human genetic disease[J].David N.Cooper,Hagop Youssoufian.Human Genetics.1988(2)
[2] Emerging strategies to overcome resistance to endocrine therapy for breast cancer[J].M.Firdos Ziauddin,Dong Hua,Shou-Ching Tang.Cancer and Metastasis Reviews.2014(2-3)
[3] Breast cancer in China[J].Lei Fan,Kathrin Strasser-Weippl,Jun-Jie Li,Jessica St Louis,Dianne M Finkelstein,Ke-Da Yu,Wan-Qing Chen,Zhi-Ming Shao,Paul E Goss.Lancet Oncology.2014(7)
[4] Nuclear Receptor Coactivators:Master Regulators of Human Health and Disease[J].Subhamoy Dasgupta,David M.Lonard,Bert W.O’Malley.Annual Review of Medicine.2014
[5]刘凛.卵巢肿瘤组织中突变型p53表达与iNOS活性及二者相关性的研究[D].中国医科大学,2003.