背景[1-3]
GL261小鼠胶质瘤细胞来自小鼠胚胎脑胶质瘤组织的成纤维贴壁细胞，含有编码命名为p185的185000道尔顿抗原的neu转化基因。p185蛋白质与胶质母细胞瘤和成神经细胞瘤癌基因的存在密切相关。neu癌基因与erb-B癌基因同源，并且p185与表皮生长因子受体在血清学上相似。
GL261小鼠胶质瘤细胞
细胞培养方法：
1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；
③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；
④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；
⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；
⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。
2、细胞复苏：
①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。
②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。
应用[4][5]
用于胶质瘤干细胞免疫靶向治疗比较实验研究
GSC的分离纯化及各种GC全抗原获取目的：有效获得分离纯化的GSC及提取各种GC全抗原,为后续实验研究奠基。
方法：1、GSC的分离纯化：参考美国模式培养物集存库（American type culture collection,ATCC）的培养方法培养小鼠GL261胶质瘤细胞,接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中,25cm2塑料培养瓶中,置于37℃,5%CO2、饱和湿度恒温培养箱中培养。每1-2天传代一次。
参照singh等人的无血清悬浮培养法培养小鼠GL261胶质瘤干细胞,于不含血清的DMEM/F12培养基中加入DMEM/F12、bFGF20ng/ml、EGF20ng/ml及1：50B27添加剂。
将细胞接种于25cm2培养瓶中,置37℃,5%C02饱和湿度培养箱中培养,每3～4天加入含上述细胞因子的新鲜培养基,7～9天传代一次。传6代左右时以流式细胞术分选出CD133（肿瘤干细胞标志分子）表达阳性的细胞,并继续无血清培养扩增细胞。
GL261胶质瘤细胞及GL261肿瘤球细胞经免疫荧光细胞化学和流式细胞术检测表面GFAP、CD133的表达,并进行GL261肿瘤干细胞球的分化试验,鉴定为胶质瘤细胞（GC）和胶质瘤干细胞（GSC）。
2、GC全抗原的获取：分别以冻融裂解法、凋亡细胞法和全RNA提取法提取GC的全抗原,备以后续提呈给未成熟DC用。
结果：实验中所用肿瘤细胞经anti-GFAP免疫荧光鉴定为小鼠GL261胶质瘤细胞系。通过无血清培养法结合流式细胞分选术,从小鼠的GL261胶质瘤细胞系中得到了较高纯度（CD133表达率80.5±5.2%）的GSC。通过对GC进行冻融裂解、诱导凋亡、提取全RNA等处理,得到了纯度、性质相对稳定的冻融裂解抗原（蛋白浓度1.9～2.1 mg/ml）、凋亡细胞抗原（纯度93.1±2.5%）和全RNA抗原（OD260/280:1.97～2.0）。
参考文献
[1]Protective properties of radio-chemoresistant glioblastoma stem cell clones are associated with metabolic adaptation to reduced glucose dependence.Ye F,Zhang Y,Liu Y,et al.PLoS One.2013
[2]Targeting cytotoxic T lymphocytes for cancer immunotherapy.Maher J,Davies E T.British Journal of Cancer.2004
[3]Regulatory dendritic cells:there is more than just immune activation.Schmidt Susanne V,Nino-Castro Andrea C,Schultze Joachim L.Frontiers in immunology.2012
[4]Dendritic cells in cancer immunotherapy.Lawarence F,Edgar G.Annual Review of Immunology.2000
[5]孙承媚.胶质瘤干细胞免疫靶向治疗比较实验研究[D].南方医科大学,2015.