背景[1-3]
人Β葡糖苷酶(Β-GLU)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人β葡糖苷酶(β-glucosidase)水平。
原理：用纯化的人β葡糖苷酶(β-glucosidase)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入β葡糖苷酶(β-glucosidase),再与HRP标记的β葡糖苷酶(β-glucosidase)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的β葡糖苷酶(β-glucosidase)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人β葡糖苷酶(β-glucosidase)浓度。
人Β葡糖苷酶(Β-GLU)ELISA试剂盒
操作步骤：
1.使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2. 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
3. 加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。
4. 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5. 每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6. 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7. 每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟，避免光照。
8. 取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9.在450nm波长处测定各孔的OD值。
应用[4][5]
用于草酸青霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及表达研究
通过提取草酸青霉（Penicillium oxalicum）S1J 1DNA与RNA,参考斜卧青霉（Penicillium decumberns）β-葡糖苷酶基因设计引物,利用PCR和RT-PCR技术分别克隆出草酸青霉β-葡糖苷酶bgl1和bgl2基因全长及cDNA。
通过测序及生物信息学分析得知bgl1基因全长2963 bp,包含5个内含子、6个外显子,编码861个氨基酸。bgl2全长1778 bp,包含3个内含子、4个外显子,编码463个氨基酸。
将BGL1的CDS序列与pPIC9K连接后,构建重组表达载体pPIC9K-bgl1。将线性化的表达质粒电击转化至毕赤酵母GS115中。通过含有0.25 mg/mL G418抗性平板、含有0.25%七叶苷和0.1%柠檬酸高铁铵平板筛选后,通过菌液PCR及以阳性转化子基因为模板PCR通过菌液PCR及以阳性转化子基因为模板PCR验证得到阳性重组工程菌GS115-pPIC9K-bgl1。
重组菌经过1.5%的甲醇诱导表达,粗酶液通过pNPG法检测具有β-葡糖苷酶活性,酶活为0.297 U/mL。SDS-PAGE电泳结果显示,表达产物约为97KDa。
通过响应面法优化得到诱导发酵培养基配方为酵母粉12.01 g、硫酸铵16.89 g、山梨醇23.41 g、甲醇1.5%,该培养基可提高表达量19.47%。
发酵粗酶液通过冻干浓缩、硫酸铵分级沉淀、透析除盐、SephadexG100层析分离后,得到纯的BGL1酶液。BGL1酶学性质分析后,其反应时间为30min,最适反应温度为50℃、最适pH为6.0,存储温度为低温、PH为6.0。Ba2+离子对BGL1酶活有极大的促进作用、Cu2+离子对BGL1酶活有极大的抑制作用。
参考文献
[1]Catalytic properties,functional attributes and industrial applications ofβ-glucosidases[J].Gopal Singh,A.K.Verma,Vinod Kumar.3 Biotech.2016(1)
[2]Modelling of amorphous cellulose depolymerisation by cellulases,parametric studies and optimisation[J].Hongxing Niu,Nilay Shah,Cleo Kontoravdi.Biochemical Engineering Journal.2016
[3]The Production of Bioethanol Fermentation Substrate from Eucheuma cottonii Seaweed through Hydrolysis by Cellulose Enzyme[J].Sekar Puspawati,Wagiman,Makhmudun Ainuri,Darmawan Ari Nugraha,Haslianti.Agriculture and Agricultural Science Procedia.2015
[4]Screening of carbon sources for beta-glucosidase production by Aspergillus saccharolyticus[J].Annette S?rensen,Julie Juel Andersen,Birgitte K.Ahring,Philip J.Teller,Mette Lübeck.International Biodeterioration&Biodegradation.2014
[5]白洋.草酸青霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及表达[D].福建师范大学,2017.