背景[1-3]
小鼠细胞分离液为Ficoll、羟乙基淀粉550与泛影酸葡甲胺的混合液。抗凝外周血可在分离液中分层。离心时，在Ficoll、羟乙基淀粉的作用下红细胞与粒细胞聚集并迅速沉降；此时，淋巴细胞及其他单个核细胞仍处于分离液上层，红细胞污染可忽略不计。大部分血小板可在细胞清洗低速离心过程中去除。其他人及动物多种比重细胞分离液，因不同种属不同比重分离液的细胞离散系数及细胞带电不同，用户在制定分离液时应提供所需分离液的比重、动物种属及被分离细胞的名称。
小鼠细胞分离液适用于从小鼠抗凝血液中分离淋巴细胞，无菌条件下分离的淋巴细胞可用于培养。
小鼠细胞
分离方法：
1.取一支15ml离心管，加入3ml分离液置于18-22℃复温。
2.将血液样本小心加于分离液之液面上。18-22℃，400g离心20分钟。低温（如4℃）离心会降低细胞得率。
3.离心后，用吸管小心吸出分离液上层（包含淋巴细胞的细胞层）0.5cm以上的上清液部分，弃去。
4.用吸管小心吸取分离液层及淋巴细胞层至于另一新离心管内。
5.在步骤4中所得离心管中加入10ml细胞洗涤液混匀。
6.250g离心10分钟。
7.弃上清。
8.用吸管以5ml细胞洗涤液重悬所得细胞。
9.250g离心10分钟。
10.弃上清。重复步骤7、8、9，后以0.5ml后续试验所需相应液体重悬细胞。
应用[4][5]
用于急性B淋巴细胞白血病人源化小鼠的T淋巴细胞免疫治疗研究
以人源化小鼠为基础,通过建立MLL-AF9融合基因诱导的人B-ALL人源化小鼠模型为受者,应用同基因人源化小鼠T细胞制备的抗CD19 CAR T细胞进行治疗。建立模拟临床患者的患病及CAR T细胞治疗过程的小鼠模型。白血病小鼠模型中的人B-ALL细胞表达CXCR4,其与白血病细胞的归巢、治疗抵抗及疾病复发相关,通过阻断基质细胞衍生因子1（stromal cell derived factor 1,SDF-1/CXCL12）/CXCR4通路,探索增强T细胞免疫杀伤B-ALL细胞的方法。
方法:在实验一,构建人B-ALL人源化小鼠模型,应用同基因抗CD19 CAR T细胞进行治疗。1.建立MLL-AF9诱导的人B-ALL人源化小鼠模型。分离人源化小鼠T细胞,制备抗CD19 CAR T细胞。应用抗CD19 CAR T细胞治疗B-ALL人源化小鼠模型。
2. 流式分析仪对小鼠模型的白血病细胞、抗CD19 CAR T细胞及其他免疫细胞进行分析,检测抗CD19 CAR T细胞在小鼠体内增殖及存活情况、白血病细胞增殖及被杀伤情况。
3. 监测小鼠血清细胞因子及生存情况,观察小鼠CAR T细胞治疗后细胞因子释放与抗白血病效应的相关性及CAR T细胞治疗效果。
以人B-ALL NSG小鼠为模型,应用异基因T细胞杀伤白血病细胞。探索能否应用CXCR4拮抗剂阻断SDF-1/CXCR4通路,使白血病细胞进入外周,从而增强T细胞杀伤白血病细胞效果。
1. 建立B-ALL NSG小鼠模型,应用异基因T细胞在体内杀伤白血病细胞。
2. 注射CXCR4拮抗剂AMD3100。
3. 检测小鼠外周血各种细胞的比例及数量,观察白血病细胞被杀伤情况及异基因移植后移植物抗宿主反应。
4. 监测小鼠生存期、检测小鼠组织器官中白血病细胞数量及比例,观察残存白血病细胞被清除的情况。
5. 过继移植治疗后小鼠骨髓细胞到NSG小鼠体内,监测疾病长期缓解情况。
结果:1.通过人类胚胎胸腺及胚胎肝脏CD34+细胞移植建立人源化小鼠模型。在移植后第7周人源化小鼠人类细胞嵌合率达49%以上。构建人B-ALL人源化小鼠模型。
2. CAR T细胞制备及体外扩增。分离人源化小鼠脾脏中T细胞,制备抗CD19 CAR T细胞及对照组CAR T细胞,并在体外扩增。转染率分别为73%和45.3%。
3. B-ALL人源化小鼠接受CAR T细胞输注治疗,发挥抗CD19阳性细胞作用。CAR T细胞输注后第1、2和第4周,抗CD19 CAR T细胞治疗组小鼠B淋巴细胞明显少于对照CAR T细胞治疗组,P值分别为0.0144,0.0047和0.0059。第6和第8周,抗CD19 CAR T细胞治疗组小鼠白血病细胞明显少于对照CAR T细胞治疗组,P值分别为<0.0001和0.0048。
4. B-ALL人源化小鼠抗CD19 CAR T细胞治疗后血清中细胞因子释放。治疗后第1周抗CD19 CAR T治疗组小鼠血清中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）及白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）显著性高于对照CAR T治疗组,P值分别为0.0095和0.0422;治疗后第4周抗CD19 CAR T治疗组小鼠血清中γ干扰素（interferon-γ,INF-γ）显著性高于对照CAR T治疗组,P值为0.0161。
5.抗CD19 CAR T细胞治疗延长B-ALL人源化小鼠生存时间。对照CAR T细胞治疗组小鼠生存时间为5182天（中位生存时间为72天）,抗CD19 CAR T治疗组小鼠生存时间为CAR T细胞治疗后86>120天（中位生存时间为99天）,生存期明显长于对照CAR T治疗组小鼠,P值为0.003。
参考文献
[1]Endothelial Activation and Blood–Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells[J].Juliane Gust,Kevin A.Hay,Laila-Aicha Hanafi,Daniel Li,David Myerson,Luis F.Gonzalez-Cuyar,Cecilia Yeung,W.Conrad Liles,Mark Wurfel,Jose A.Lopez,Junmei Chen,Dominic Chung,Susanna Harju-Baker,Tahsin Ozpolat,Kathleen R.Fink,Stanley R.Riddell,David G.Maloney,Cameron J.Turtle.Cancer Discovery.2017(12)
[2]Intent-to-treat leukemia remission by CD19 CAR T cells of defined formulation and dose in children and young adults[J].Rebecca A.Gardner,Olivia Finney,Colleen Annesley,Hannah Brakke,Corinne Summers,Kasey Leger,Marie Bleakley,Christopher Brown,Stephanie Mgebroff,Karen S.Kelly-Spratt,Virginia Hoglund,Catherine Lindgren,Assaf P.Oron,Daniel Li,Stanley R.Riddell,Julie R.Park,Michael C.Jensen.Blood.2017(25)
[3]T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults:a phase 1 dose-escalation trial[J].Daniel W Lee,James N Kochenderfer,Maryalice Stetler-Stevenson,Yongzhi K Cui,Cindy Delbrook,Steven A Feldman,Terry J Fry,Rimas Orentas,Marianna Sabatino,Nirali N Shah,Seth M Steinberg,Dave Stroncek,Nick Tschernia,Constance Yuan,Hua Zhang,Ling Zhang,Steven A Rosenberg,Alan S Wayne,Crystal L Mackall.The Lancet.2015(9967)
[4]Humanized Mice Reveal Differential Immunogenicity of Cells Derived from Autologous Induced Pluripotent Stem Cells[J].Tongbiao Zhao,Zhen-ning Zhang,Peter D.Westenskow,Dilyana Todorova,Zheng Hu,Tongxiang Lin,Zhili Rong,Jinchul Kim,Jingjin He,Meiyan Wang,Dennis O.Clegg,Yong-guang Yang,Kun Zhang,Martin Friedlander,Yang Xu.Cell Stem Cell.2015(3)
[5]金春卉.急性B淋巴细胞白血病人源化小鼠的T淋巴细胞免疫治疗研究[D].吉林大学,2018.