背景[1-3]
硬组织线粒体分离试剂盒是快速便捷分离组织中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE、Western、双向电泳等蛋白分析。
线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需的能量主要由在线粒体内进行的氧化所产生的能量来供应。制备线粒体的关键是保持线粒体的完整性和纯度，可通过分级分离法获得，即先低俗出去细胞核以及细胞碎片，再进行高速梯度离心分离线粒体。
硬组织线粒体分离试剂盒
操作步骤：
1、清洗：取新鲜组织(不宜采用冻存的组织)，迅速称重50～100mg，用预冷的PBS清洗1次，冰上剪成3mm2大小的组织碎片。
2、匀浆裂解：加入10倍体积的预冷的Mitochondria Lysis buffer(如需获得细胞浆蛋白，应提前加入PMSF，至PMSF浓度为1×)，置于冰浴上Dounce匀浆器中，匀浆10～20次。不同组织或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。
3、离心：4℃，600g离心5min以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。
4、上清液转移至一干净离心管，4℃12000g离心10min。
5、弃上清，沉淀为线粒体，如果希望获得去除线粒体的细胞浆蛋白，应在本步骤中收集上清，并且在收集上清时注意勿触及沉淀。随后把收集的上清12000g，4℃离心10min，上清即为去除线粒体的细胞浆蛋白。
6、保存：弃上清，用适当缓冲液悬浮沉淀。如果用于线粒体酶活性或功能的分析，线粒体沉淀应重悬于Mitochondria Stock buffer。
应用[4][5]
用于玉米同核异质及同质异核雄性不育系线粒体基因组比较分析研究
实验以两套同核异质材料C48-2、48-2,C黄早四、黄早四和一套同质异核玉米材料C48-2、C黄早四、C698-3、C478作为研究对象。通过蔗糖衬垫法分离玉米线粒体并提取其DNA,采用IlluminaHiseq2500平台对玉米线粒体基因组进行测序分析,利用Denovo组装和Gap内洞拼接得到完整线粒体基因组序列,进而分析两套同核异质玉米线粒体基因组间的差异,挖掘细胞质雄性不育的候选基因;通过同质异核材料间细胞质基因组的生物信息学分析,探究核质互作对细胞质基因组的影响。
本研究所得主要结果如下:1.C48-2、C黄早四、C698-3、C478和48-2、黄早四线粒体基因组测序数据过滤后均大于1GB。基因组组装结果分别为739,660bp（C48-2）、739,653bp（C黄早四）、739,607bp（C478）、739,643bp（C698-3）和566,154bp（48-2）、566,503bp（黄早四）,GC含量均约为44%。C48-2、C黄早四、48-2和黄早四叶绿体基因组的组装结果分别为140,473bp（C48-2）、140,478bp（C黄早四）、140,458bp（48-2）、140,448bp（黄早四）,GC含量均为38.4%。
2. 通过6个供试材料线粒体基因组的序列同源性和共线性比较,发现C型不育系和保持系（48-2、黄早四）线粒体基因组保守区域共线性较高,但这些保守序列段的排列顺序及方向存在差异。C型不育系线粒体基因组中存在总长约为241kb的大片段重复序列,而可育材料中的大片段重复序列较少,简单重复序列（SSR）的检索结果也显示,线粒体基因组中存在大量的五、六碱基单元的重复序列,且不育材料比可育材料中数量更多。
3. 六个材料线粒体基因组均注释到33个已知蛋白编码基因,对这些基因的序列进行比对发现nad4L、cob、cox3、atp9、rps4基因在不同细胞质线粒体基因组中的拷贝数存在差异;atp4、atp6、cox2、nad2、rps2B基因在不同细胞质线粒体基因组中的基因序列信息存在差异。通过预测这些差异基因的二级结构和跨膜结构域并进行比较分析,发现基因内部分碱基序列的变异可造成蛋白质二级结构的变化,并引发其功能的改变。
4. 两套同核异质玉米叶绿体基因中均注释到84种蛋白编码基因、30种tRNA基因和4中rRNA基因,只是不同材料间部分基因的拷贝数存在差异。共线性比较分析发现,叶绿体基因组结构高度保守,基本没有发现序列片段的重组;并且根据四种材料叶绿体基因组上的变异位点（SNP与InDel）分析,显示大多数的单碱基变异和所有的插入缺失都发生在基因组Poly结构区域。
5.通过两套玉米同核异质系C48-2、48-2,C黄早四、黄早四线粒体与叶绿体基因组的结构信息、重复序列、编码基因以及变异位点的比较,可以看出不育胞质线粒体基因组较可育胞质更复杂,主要原因可能是其存在大量的重复序列,而叶绿体基因组则高度保守。而玉米同质异核系C48-2、C黄早四、C698-3、C478线粒体和叶绿体基因组比较分析显示不同细胞核背景对同一细胞质中线粒体和叶绿体基因组影响较小,主要发生在重复序列和基因间隔区存在一些差异,而编码基因的碱基序列基本没有差异。
参考文献
[1]Male Sterility and Fertility Restoration in Crops[J].Letian Chen,Yao-Guang Liu.Annual Review of Plant Biology.2014
[2]Identification of mitochondrial DNA sequence variation and development of single nucleotide polymorphic markers for CMS-D8 in cotton[J].Hideaki Suzuki,Jiwen Yu,Fei Wang,Jinfa Zhang.Theoretical and Applied Genetics.2013(6)
[3]Rapid Evolution of Enormous,Multichromosomal Genomes in Flowering Plant Mitochondria with Exceptionally High Mutation Rates[J].Daniel B.Sloan,Andrew J.Alverson,John P.Chuckalovcak,Martin Wu,David E.McCauley,Jeffrey D.Palmer,Douglas R.Taylor.PLOS Biology.2012(1)
[4]Recombination and the maintenance of plant organelle genome stability[J].AlexandreMaréchal,NormandBrisson.New Phytologist.2010(2)
[5]邱涛.玉米同核异质及同质异核雄性不育系线粒体基因组比较分析[D].四川农业大学,2017.