背景[1-3]
RL95-2细胞源自一名65岁白人女性子宫内膜腺癌组织，1983年由DL Way建系。该细胞表达α-角蛋白，细胞表面具有微绒毛。
RL95-2细胞
培养步骤：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。
3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。
应用[4][5]
用于富血小板血浆（Platelet-rich Plasma，PRP）对RL95-2细胞增殖及对子宫内膜容受性的影响研究
研究评估PRP对体外培养RL95-2细胞增殖的影响,观察PRP在体外促进细胞增殖的浓度,探讨PRP 3D培养RL95-2细胞的可行性,观察PRP是否可以增加RL95-2细胞在通过静电纺丝技术制成的3D细胞生长支架上的粘附作用。
并通过对薄型子宫内膜模型SD大鼠宫腔灌注PRP,观察PRP是否能够改变大鼠子宫内膜厚度及容受性,修复经无水乙醇化学性损伤后的大鼠子宫内膜功能层。
并将自体PRP宫腔灌注到反复着床失败及薄型子宫内膜患者宫腔里,观察反复着床失败患者及薄型子宫内膜患者通过PRP宫腔灌注治疗后行冷冻胚胎复苏移植后的临床妊娠率、胚胎流产率及胚胎着床率的改变,探讨PRP在治疗薄型子宫内膜,提高反复着床失败患者子宫内膜容受性,改善临床妊娠率可行性。
方法取5名健康志愿者空腹静脉血17.5毫升,添加2.5毫升抗凝剂,采用两步离心法：分离获得PRP,向PRP中添加10%CaCl2及凝血酶冻干粉缓冲液混合使之活化。将活化后的PRP加入RL95-2细胞培养液中,根据PRP及培养液中胎牛血清的不同浓度进行分组,MTT法测量不同浓度PRP及胎牛血清组RL95-2细胞的增殖曲线。将制备的PRP放入96孔板中,根据其是否激活分为AB两组,测用ELISA方法测量两组PRP在体外不同时间段释放的生长因子VEGF、TNF-β、IGF、EGF、PDGF的浓度,动态观察两组PRP在不同时间段分泌生长因子的浓度变化。
将PRP与3D培养的RL95-2细胞共培养7天,行石蜡包埋切片后HE染色,观察PRP是否可以促进3D培养支架中RL95-2细胞的活性,将激活后的PRP作为3D支架,将RL95-2作为种子细胞种植在PRP上,观察细胞在PRP支架上的存活情况。对3D培养的细胞进行免疫组织化学染色,观察RL95-2细胞在3D培养条件下是否能够正常表达孕激素受体。
通过无水乙醇宫腔灌注对大鼠子宫内膜造成化学性损伤,获得大鼠薄型子宫内膜动物模型,造模成功后对治疗组大鼠行PRP宫腔灌注,通过HE染色的方法观察PRP宫腔灌注后对大鼠子宫内膜的修复作用,通过对大鼠子宫内膜波形蛋白、血管内皮生长因子及整合素的观察证实PRP宫腔灌注后是否可以改善大鼠子宫内膜容受性。
反复着床失败治疗组患者及薄型子宫内膜患者于冻胚复苏周期行PRP宫腔灌注2-3次,薄型子宫内膜患者在月经干净3-5天行宫腔镜检查,同微型剪分别在子宫前后壁及侧壁行微刺激,观察治疗组患者PRP宫腔灌注前后子宫内膜厚度的改变,当内膜厚度达到移植标准之后,再进行冷冻胚胎复苏移植,对治疗组患者的相关实验数据进行统计,具体包括患者的临床妊娠率、流产率及胎儿出生情况。
结果（1）PRP与RL95-2细胞共培养,可促进RL95-2细胞的增殖,RL95-2细胞生长曲线表明在PRP浓度1%联合血清浓度2%及10%的培养液中增殖速度最快,且培养72小时后细胞增殖明显。在无血清培养液中PRP共培养的RL95-2细胞增殖活性明显增高,低浓度（1%及2%）PRP对RL95-2细胞的增殖活性优于高浓度（5%及10%）PRP。
（2）PRP体外无论是否激活均可以持续分泌VEGF、TNF-β、PDGF、EGF等生长因子,生长因子浓度随天数增加而持续增加。
（3）PRP可以促进RL95-2细胞在3D细胞培养支架中中细胞的粘附;以PRP为3D支架,培养RL95-2细胞,石蜡包埋切片后,可见支架表面RL95-2生长,但因支架空隙小,内部无细胞生长。
参考文献
[1]Absence of correlation between follicular fluid volume and follicular granulocyte colony-stimulating factor,a predictor of embryo implantation and successful delivery.[J].No?l Laure,Donneau Anne-Fran?oise,Jouan Caroline,Schoenen Sophie,Lédée Nathalie,Foidart Jean-Michel,Nisolle Michelle,Munaut Carine.Gynecological endocrinology:the official journal of the International Society of Gynecological Endocrinology.2020(3)
[2]Clinical performance of a specific granulocyte colony stimulating factor ELISA to determine its concentration in follicular fluid as a predictor of implantation success during in vitro fertilization.[J].Tournaye H,D’Hooghe T,Verheyen G,Devreker K F,Perrier d’Hauterive S,Nisolle M,Foidart J-M,Munaut C,Noel L.Gynecological endocrinology:the official journal of the International Society of Gynecological Endocrinology.2020(1)
[3]Upregulation of HB-EGF,Msx.1,and miRNA Let-7a by administration of calcitonin through mTOR and ERK1/2 pathways during a window of implantation in mice.[J].Shokrzadeh Naser,Alivand Mohammad Reza,Abedelahi Ali,Hessam Shariati Mohammad Bakhtiar,Niknafs Behrooz.Molecular reproduction and development.2018(10)
[4]Deep tissue injury in development of pressure ulcers:a decrease of inflammasome activation and changes in human skin morphology in response to aging and mechanical load.[J].Olivera Stojadinovic,Julia Minkiewicz,Andrew Sawaya,Jonathan W Bourne,Peter Torzilli,Juan Pablo de Rivero Vaccari,W Dalton Dietrich,Robert W Keane,Marjana Tomic-Canic.PLoS ONE.2018(8)
[5]刘玲.富血小板血浆（Platelet-rich Plasma，PRP）对RL95-2细胞增殖及对子宫内膜容受性的影响[D].山东大学,2020.