背景及概述
阿尔泰金莲花为毛茛科金莲花属植物阿尔泰金莲花的干燥花蕾,主产于我国新疆北部塔城、阿勒泰等地区。作为哈萨克族习用药材,该植物具有清热解毒、止血止咳之功效,临床上用于上呼吸道感染的治疗。金莲花属植物的主要特征性成分为黄酮碳苷类化合物,其中荭草素-2''-O-β-L-半乳糖苷是阿尔泰金莲花中含量较高的成分之一。该成分具有抗氧化、抗炎等生物活性。近年来对金莲花属植物化学成分的研究主要集中于其主要标志性成分荭草苷和牡荆苷,而对荭草素-2''-O-β-L-半乳糖苷的研究笔者鲜见文献报道。因此,笔者在含量测定的基础上,通过正交实验设计考察了提取溶剂、提取时间、提取次数和料液比对总黄酮和OGA提取率,优选总黄酮和OGA的提取工艺,以期为阿尔泰金莲花的开发利用提供参考[1]。
制备
材料与仪器
药材于2016年6月采自新疆阿勒泰地区,经新疆药物研究所何江副研究员鉴定,为阿尔泰金莲花的干燥花蕾;药材使用前粉碎,过40目筛(筛孔内径0.45μm),备用。
试剂高效液相色谱测定用OGA对照品(上海源叶生物科技有限公司,含量:98.00%),UV测定用OGA对照品(新疆维吾尔自治区药物研究所植化实验室自制,含量:95.01%),色谱纯乙腈和甲醇,无水乙醇、磷酸等其他试剂均为国产分析纯。
方法与结果
阿尔泰金莲花提取液的制备
精密称取阿尔泰金莲花干燥药材粉末(过40目筛)1.0g,置圆底烧瓶,加入70%乙醇20mL,加热回流提取2h,趁热滤过,滤液采用70%乙醇定容至50mL,摇匀,备用。
HPLC法测定阿尔泰金莲花中OGA的含量
对照品溶液的配制
精密称取OGA对照品5.0mg,加甲醇定容至25mL棕色量瓶,制成0.20mg·mL-1 OGA对照品储备溶液。
供试品溶液的制备
精密量取阿尔泰金莲花提取液1.5mL,蒸干,加适量纯水溶解,移至25mL量瓶定容,用微孔滤膜(孔径0.45mm)滤过,取续滤液作为供试品溶液。
HPLC色谱条件
色谱柱为C18柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相为乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)(梯度洗脱:0~10min15%→19%A,>10~15min19%→25%A,>15~25min25%→15%A),柱温30℃,流速1.0mL·min-1,检测波长345nm,进样量10μL。按照此色谱条件分析OGA对照品及供试品溶液,色谱图见图1。系统适用性良好,理论板数>7000,拖尾因子0.95~1.05,分离度均>1.5;样品中其他组分均水干扰OGA的测定。
线性关系考察
精密量取OGA对照品储备溶液0.1,0.2,0.5,1.0,2.0和5.0mL,分别置10mL棕色量瓶,加甲醇定容至刻度,摇匀。精密吸取各对照品溶液10μL进样,记录峰面积。以峰面积为纵坐标(Y),OGA浓度(mg·mL-1)为横坐标(X),进行线性拟合,得回归方程为Y=16903577.5201X+50280.5594,r=0.9999,表明样品在0.0020~0.1000mg·mL-1浓度范围内线性关系良好。
图1 OGA对照品及供试品溶液色谱图
UV法测定总黄酮含量
对照品溶液的制备
精密量取OGA对照品(实验室自制)5.0mg,置25mL量瓶,加70%乙醇溶解至刻度,摇匀即得0.2mg·mL-1对照品储备液。
供试品溶液的制备
精密称取阿尔泰金莲花提取液2.5mL蒸干,加适量70%乙醇溶解,定容至10mL量瓶,作为供试品溶液。
检测波长的确定
将OGA对照品(Ⅰ)和供试品溶液(Ⅱ)显色后分别置于紫外分光光度计中进行光谱扫描,结果表明二者均在500nm波长处有吸收,故选择波长500nm。
标准曲线的绘制
分别精密吸取对照品溶液0,1.0,2.0,3.0,5.0,7.0mL分别置于25mL量瓶,各加水至8.0mL,加5%亚硝酸钠溶液1.0mL,混匀,放置6min后,加10%硝酸铝溶液1.0mL,混匀放置6min;再加4%氢氧化钠试液10.0mL,加水至刻度,摇匀放置15min,以相应试剂为空白,在500nm波长处测定吸光度(A),以A为纵坐标,浓度(C)为横坐标绘制标准曲线,得回归方程A=9.2694C+0.0182,r=0.9997,线性范围0.008~0.056mg·mL-1。
稳定性实验
精密量取供试品溶液1.0mL,分别置25mL量瓶,各加水使成8.0mL,加5%亚硝酸钠溶液1.0mL”起操作,显色后室温放置,分别在10,15,20,30,45和60min测定A,A的RSD为0.41%,表明供试品溶液在显色后60min内稳定性良好。
重复性实验
精密称取阿尔泰金莲花干燥药材粉末(过40目筛)1.0g,共6份。分别置于圆底烧瓶,从中精密量取1.0mL,分别置于25mL量瓶中,各加水至8.0mL,加5%亚硝酸钠溶液1.0mL,计算得总黄酮平均含量为159.70mg·g-1,RSD为0.15%,表明重复性良好。
回收率实验
精密称取已知含量的药材粉末共6份,每份约0.5g,置圆底烧瓶中,精密加入定量OGA对照品,制备供试品溶液,从中精密量取1.0mL,分别置于25mL量瓶,各加水至8.0mL,加5%亚硝酸钠溶液1.0mL”起操作,平均回收率为99.84%,RSD为1.86%。
总结
笔者在本研究建立了阿尔泰金莲花总黄酮及其标志性成分OGA的含量测定方法。结合单因素实验结果,进一步以总黄酮和OGA含量为评价指标,确定阿尔泰金莲花总黄酮及OGA的提取工艺是料液比为1:30(g·mL-1)的70%乙醇回流提取2次,每次1.5h。3个评价指标具有较好的相关性,即随着OGA含量的增大,总黄酮及其抗氧化能力也在增大,说明OGA是阿尔泰金莲花及其总黄酮抗氧化活性的物质基础之一。本实验优化的工艺简便,重复性好,可为阿尔泰金莲花的进一步开发利用提供理论依据。
参考文献
[1] 郝彩琴,李军,冷晓红.金莲花化学成分研究进展及前景展望[J].北方药学,2015,12(11):87-88.