背景[1-3]
FITC标记抗体是将FITC与特异性抗体经适当方法连接而成，FITC（异硫氰酸荧光素）能与各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，其应用范围非常广泛，结果即时可见、敏感性高。
FITC标记抗体的原理
FITC异硫氰酸荧光素是一种常用的标记抗体的方法。FITC一般为黄色。棕色或棕色粉末或结晶，在低温下可保存数年。在碱性条件下，FITC的碳酰胺键可与抗体蛋白上的赖氨酸氨基结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。抗体分子最多可标记15~20个FITC分子。标记的抗体仍能保持与相应抗原结合的能力，在荧光源紫外线或蓝紫光的刺激下产生黄绿色荧光，通过荧光显微镜观察或使用流细胞仪进行分析，从而定性、定位或定量抗原。
FITC标记抗体原位杂交
FITC标记抗体实验流程
（1）用500ml FITC标记缓冲液在4℃透析纯化的单抗，共2d。期间更换2或3次缓冲液（通常情况下，5ml的1-2mg/ml的抗体可以用500ml缓冲液）。在A280处检测吸光度，确定抗体浓度（=A280×0.74×稀释倍数）。
（2）每毫克抗体加入20微升的5mg/ml FITC。室温孵育2h。
（3）用透析液透析去除未结合的FITC，共2d。期间更换2或3次缓冲液。或者过Sephadex G-25去除。
（4）用透析液稀释FITC-lgG复合物，使A280＜2.0。在A280和A492处检测吸光度，计算蛋白质浓度。
蛋白质（mg/ml）=A280-（A492×0.35）/1.4（FITC标记抗体摩尔系数的倒数）
应用[4][5]
用于应用布鲁菌外膜蛋白单克隆抗体检测布病患者外周血PBMCs中菌体抗原的研究
通过制备、筛选和鉴定特异性布菌外膜蛋白单克隆抗体,建立针对布病患者外周血单个核细胞（PBMCs）内布菌抗原的流式细胞检测方法,用于布病临床治疗效果评价。
方法：1.材料重组布菌外膜蛋白Omp31、Bp26和Omp25;布菌外膜蛋白特异性单克隆抗体及其杂交瘤细胞;灭活布菌菌体,包括牛种（B.abortus 2308、104M和S19菌株）,羊种（B.melitensis M5-90）和猪种（B.suis S2）;异硫氰酸荧光素（FITC）,藻红蛋白（r-PE）标记试剂盒。
2. 研究对象52名布病患者的全血样本作为实验组,55名健康献血者的全血样本作为健康对照组。新鲜分离布病患者与献血者PBMCs。
3. 实验方法3.1纯化制备单克隆抗体:杂交瘤细胞经有限稀释法重新克隆,收集单克隆细胞后腹腔接种小鼠,制备的腹水用Protein G柱纯化,获得多个批次的单抗,经Nanodrop2000测定浓度,SDS-PAGE鉴定纯度。3.2筛选及鉴定单克隆抗体:ELISA鉴定纯化后单抗的效价和亲和力。多肽ELISA用于Omp25的5株单抗抗原表位识别的鉴定,双抗夹心ELISA筛选其配对抗体。3.3特异性单抗与常见三种布菌（牛种、羊种和猪种）的反应:利用Western blot（WB）、ELISA方法对牛、羊、猪三种布菌菌种进行鉴定。3.4流式细胞术（FCM）检测细胞内布菌抗原:用异硫氰酸荧光素（FITC）和藻红蛋白（r-PE）标记单抗,通过FCM检测真核表达载体转染的细胞,以及健康献血者和布病患者的单个核细胞（PBMCs）,分析该方法的临床应用价值。
结果1.针对布菌Omp31、Bp26和Omp25筛选及制备出了一批效价约为1:20万,纯度大于90%的单克隆抗体,适用于ELISA、WB及细胞免疫荧光（IFS）等免疫学方法对多种布菌抗原的检测。
2. 细致分析与鉴定了5株Omp25单抗的识别表位,其中4株单抗（4A12和4F10、8F3、2B10）识别三个不同线性表位（P2、P4和P7）,1株单抗（6C12）识别一个半构象表位。实验优化选出8F3/6C12-HRP和8F3/4A12-HRP两组配对抗体用于ELISA检测布菌抗原,其中6C12和4A12适合作为检测抗体,8F3适合作为捕获抗体。
3.选用6C12单抗进行荧光素标记,FCM检测布病患者PBMCs携带布菌的频率。
结果显示：PBMCs布菌阳性频率>1%（设定的Cutoff本底值）的布病患者为42.3%（22/52）,其FCM检测的PBMCs阳性频率与携带布菌数呈正相关。
结论：研究制备了用于布菌外膜蛋白免疫检测的多株单克隆抗体,以Omp25特异性单抗6C12建立了流式细胞术用于检测布病患者外周血PBMCs中布菌抗原,为布病诊断或临床治疗效果评价提供了新方法。
参考文献
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[5]杨鑫.应用布鲁菌外膜蛋白单克隆抗体检测布病患者外周血PBMCs中菌体抗原的研究[D].南方医科大学,2020.