背景[1-3]
小鼠黑色素瘤细胞源于C57BL/6J小鼠黑色素瘤,可以产生黑色素,同基因小鼠体内移植可成瘤,1:3传代,2-3天换液一次。
一.培养基及培养冻存条件准备
1)准备1640基础培养基(推荐:iCell-0002),优质胎牛血清10%,P/S 1%
细胞代谢旺盛,培养基容易变黄,需要及时换液。
2)培养条件:气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37摄氏度,培养箱湿度为70%-80%。
3)冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。
小鼠黑色素瘤细胞
二.细胞处理:
1)冻存细胞的复苏:
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min,弃去上清液,完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶(或皿)中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
对于贴壁细胞传代可以参考以下方法:
1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加入0.25%(w/v)胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中(T25瓶1-2mL,T75瓶2-3mL),置于37℃培养箱中消化1-2分钟(难消化的细胞可以适当延长消化时间),然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。
3.轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心3-5min,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1:2的比例分到新T25瓶中,添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力,后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
3)细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。
应用[4][5]
用于SHCBP1介导白藜芦醇调控小鼠黑色素瘤细胞增殖及迁移的机制研究
基于前期研究发现白藜芦醇抑制小鼠黑色素瘤B16细胞中SHCBP1的表达水平的结果,采用CCK-8、流式细胞术、Western Blot、Ed U染色等方法阐明白藜芦醇在抑制小鼠黑色素瘤(B16)细胞的分子机制,并进一步阐明SHCBP1在B16细胞中的生物学作用。
本研究主要获得实验结果如下:1、白藜芦醇抑制B16细胞增殖、细胞集落形成和细胞迁移。这种影响是由于白藜芦醇抑制B16细胞中ERK及AKT信号通路,并促进细胞周期抑制因子p21、p27、p53蛋白的表达。同时发现白藜芦醇抑制B16细胞中SHCBP1蛋白的表达。
2、SHCBP1在B16细胞中本底表达较高。通过获得干扰SHCBP1的B16细胞株,利用转录组测序分析差异基因KEGG通路,发现差异基因主要富集在细胞增殖、凋亡、氧化及炎症相关通路,说明SHCBP1的确影响B16细胞增殖。
3、在B16细胞中单独干扰和超表达SHCBP1,结果发现SHCBP1加速B16细胞G1/S期进程,促进ERK和AKT的磷酸化,进一步影响Cyclin D1和P21的表达水平,从而调控细胞增殖过程。
4、分别在SHCBP1干扰和超表达的情况下,用白藜芦醇处理B16细胞,结果发现,白藜芦醇抑制SHCBP1的表达,调控ERK信号通路从而影响B16细胞的细胞增殖,另一方面,白藜芦醇也通过AKT信号通路发挥调控B16细胞增殖效应。
结论:本研究阐明白藜芦醇通过抑制SHCBP1/ERK和AKT信号通路抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖及迁移能力。为白藜芦醇临床治疗提供实验支撑,SHCBP1作为治疗黑色素瘤的临床诊断和靶向治疗提供理论依据和实验基础。
参考文献
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[2]FGF13 interaction with SHCBP1 activates AKT-GSK3α/βsignaling and promotes the proliferation of A549 cells[J].Cancer Biology&Therapy.2020(11)
[3]NRASQ61K melanoma tumor formation is reduced by p38-MAPK14 activation in zebrafish models and NRAS-mutated human melanoma cells.[J].Banik Ishani,Cheng Phil F,Dooley Christopher M,Travnickova Jana,Merteroglu Munise,Dummer Reinhard,Patton Elizabeth E,BuschNentwich Elisabeth M,Levesque Mitchell P.Pigment cell&melanoma research.2020
[4]Curcumol inhibits the proliferation and metastasis of melanoma via the miR-152-3p/PI3K/AKT and ERK/NF-κB signaling pathways.[J].Ning Ning,Liu Sulai,Liu Xiehong,Tian Zeyu,Jiang Yu,Yu Nanhui,Tan Boyu,Feng Hao,Feng Xing,Zou Lianhong.Journal of Cancer.2020(7)
[5]孙志阳.SHCBP1介导白藜芦醇调控小鼠黑色素瘤细胞增殖及迁移的机制研究[D].陕西理工大学,2021.