反式-2-己烯醇的制备及其毒性评估

简介

反式-2-己烯醇简称为2-己烯醇，是新鲜覆盆子香气的组分之一，在巴伦西亚橙汁和苹果中曾检出过该物质，大多数情况下作为酯类形式存在于自然界。常用于调配苹果、草莓、橙子、蔬菜、茶、猕猴桃、西红柿、香蕉、薄荷、梨子、浆果等食用香精。在最终加香食品中反式-2-己烯醇的浓度约为0.63~4.1 mg/kg[1-2]。

图1 反式-2-己烯醇的结构式。

制备

图2 反式-2-己烯醇的合成路线[3]。

将带有（Z）-2-己烯-1-醇（174）和正丁基锂（2.5 M己烷，0.5 mL，1.25 mmol）的机械探针滴加到醇（174）（0.145 mL，1.22 mmol）在THF（8 mL）中的冷却（0℃）溶液中。在通过套管加入催化剂之前，将醇盐脱气两次：（a）在THF（12mL）中的[Rh（dppe）COD]ClO4（44.5mg，0.063mmol）。在这种情况下，反应回流5分钟，然后用饱和氯化铵水溶液（10mL）猝灭。分离各层，用乙醚（2 x 10 mL）萃取水相。合并的有机相用盐水（10ml）洗涤，干燥（MgSO4）并蒸发。对每个粗反应混合物进行NMR分析。最终确定所合成的化合物为反式-2-己烯醇。合成路线如图2所示。

图3 反式-2-己烯醇的合成路线[4]。

生物转化和产物形成的分析含有LOX和HPL表达质粒的酵母菌株的培养物在带有适当SCD脱落培养基的挡板摇瓶中生长至OD600nm为1.0，并直接用于生物转化或通过离心收获。在该缓冲液（OD600nm为1.0）中再悬浮后，将15ml转移至100ml带挡板的摇瓶中。通过添加58μl底物溶液（50μl乙醇与8μl 70%纯亚麻酸混合）开始使用生长细胞或静止细胞进行生物转化。烧瓶在25°C下在轨道振动器（180 rpm）上孵育。为了对生物转化过程中形成的挥发物进行定性分析，我们在60分钟生物转化10分钟后，将75μm CarboxenTM PDMS固相微萃取（SPME）纤维（Supelco，Bellefonte，PA，USA）暴露于烧瓶顶部空间。通过GC-FID（GC 17A，Shimadzu，Kyoto，Japan）进行分析。确定目标的化合物为反式-2-己烯醇。合成路线如图3所示。

图4 反式-2-己烯醇的合成路线[5]。

在室温下，向二氯化物5a（17 mg，0.04 mmol）在HMPA（0.7 mL）中的搅拌溶液中加入NaI（154 mg，1.03 mmol），并将混合物在160℃下加热2小时。加入饱和Na2S2O3后，将混合物倒入分液漏斗中，并用Et2O萃取。分离有机相，用MgSO4干燥，过滤并浓缩。残余物通过快速硅胶柱色谱（EtOAc/己烷1:6）纯化，得到无色油状的中间体。然后继续用TBAF脱乙酰化：在室温下向上述获得的（E）-烯烃（67mg，0.20mmol）在THF（1.7mL）中的溶液中加入TBAF（1.0M在THF中，0.26mL，0.26mmol），并将混合物搅拌45分钟。加入饱和NH4Cl后，将混合物倒入分液漏斗中并用EtOAc萃取。分离有机相，用MgSO4干燥，过滤并浓缩。残余物通过快速硅胶柱色谱（EtOAc/己烷1:4）纯化，得到无色油状反式-2-己烯醇，产率10.5mg，53%。IR（纯）ν3354、2959、1456、968 cm-1；1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ：5.75-5.58（m，2H），4.09（d，2H，J=4.7 Hz），2.06-1.99（m，2H），1.53（brs，1H），1.48-1.32（m，3H），0.91（t，3H，J=7.3 Hz）；13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ：133.3、129.0、63.8、34.3、22.2、13.6。合成路线如图4所示。

遗传毒性

根据目前的现有数据和使用水平，反式-2-己烯醇不存在遗传毒性问题。在BlueScreen分析中评估了反式-2-己烯醇，发现在S9代谢激活的情况下遗传毒性为阴性，在没有S9代谢活化的情况下，遗传毒性为阳性，表明存在遗传毒性潜力。根据GLP法规和OECD TG 471，使用Ames致突变试验评估反式-2-己烯醇的致突变活性。鼠伤寒沙门氏菌菌株TA98、TA100、TA1535、TA1537和大肠杆菌WP2uvrA在存在和不存在S9代谢活化的情况下，采用平板掺入法，在二甲基亚砜（DMSO）中以1.5–5000μg/平板的浓度用反式-2-己烯醇处理。在S9存在或不存在的任何测试剂量下，均未观察到回复菌落的平均数量增加。在本研究条件下，反式-2-己烯醇被认为不致突变[6]。

皮肤过敏

基于DST的应用，反式-2-己烯醇不会引起皮肤过敏。这种材料的化学结构表明，预计它不会与皮肤蛋白发生反应。局部淋巴结测定（LLNA）报告反式-2-己烯醇是一种弱敏化剂，EC3计算值为60%或15000 μg/cm2。对25名受试者进行的验证性人类化测试，反式-2-己烯醇不会对任何受试者产生致敏反应[6]。

参考文献

[1] J. Huang, C. Huang, Kelp flavor comprises e.g. dimethyl sulfide, heptaldehyde, methyl terpineol, ethyl ionone, palmitic acid, basilene, citral, lactate B Ester, hexanal, ethyl acetate, trimethylamine, octenol, trans-2-hexenol, hexanol and propylene glycol.

[2] T. Tuszynski, T. Tarko, M. Kun, Volatile six carbon compounds in alcoholic beverages, Zywnosc 6(4) (1999) 39-53.

[3] D.A. Sandham, A novel entry into enolate anion chemistry, 1993, p. No pp.

[4] M. Buchhaupt, J.C. Guder, M.M.W. Etschmann, J. Schrader, Synthesis of green note aroma compounds by biotransformation of fatty acids using yeast cells coexpressing lipoxygenase and hydroperoxide lyase, Appl. Microbiol. Biotechnol. 93(1) (2011) 159-168.

[5] T. Yoshimitsu, N. Fukumoto, T. Tanaka, Enantiocontrolled Synthesis of Polychlorinated Hydrocarbon Motifs: A Nucleophilic Multiple Chlorination Process Revisited, J. Org. Chem. 74(2) (2009) 696-702.

[6] A.M. Api, D. Belsito, D. Botelho, M. Bruze, G.A. Burton, J. Buschmann, M.L. Dagli, M. Date, W. Dekant, C. Deodhar, M. Francis, A.D. Fryer, L. Jones, K. Joshi, S. La Cava, A. Lapczynski, D.C. Liebler, D. O'Brien, A. Patel, T.M. Penning, G. Ritacco, J. Romine, N. Sadekar, D. Salvito, T.W. Schultz, I.G. Sipes, G. Sullivan, Y. Thakkar, Y. Tokura, S. Tsang, RIFM fragrance ingredient safety assessment, trans-2-Hexenol, CAS Registry Number 928-95-0, Food and Chemical Toxicology 118 (2018) S49-S58.