背景[1-3]
鱼粉蛋白胨是将鱼粉酶解后的干燥产品,产品中有油脂,大分子蛋白质等。
鱼粉蛋白胨制备方法：将鱼糜加工下脚料原料经绞碎、石油醚脱脂,得到鱼糜浆,用0.1％木瓜蛋白酶酶解,离心收集上清(即鱼水解蛋白胨溶液),经300 Da纳滤膜脱盐和浓缩,喷雾干燥后,获得淡黄色粉末,即鱼蛋白胨样品FZU01。
鱼粉蛋白胨
对鱼蛋白胨FZU01和鱼粉蛋白的主要理化指标(澄明度、亚硝酸盐和碱性沉淀、酸碱度、含氮量、氨基氮、干燥失重、炽灼残渣)进行检测;在固定酵母提取物、NaCl浓度、初始pH和接种量的基础上,分别用两种蛋白胨配制LB培养基,接种大肠埃希菌,检测A600值;采用分子筛高效液相色谱法(size-exclusion high-performance liquid chromatography,SEC-HPLC)检测两种蛋白胨的相对分子质量.分别将50、150、300、600、900、1 200和1 500 mg/L组胺以及0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0和50.0 mg/L重金属离子(Hg2+、Cd2+、As3+、Cr6+和pb2+)加至大肠埃希菌中,37℃培养12h,检测A600值.结果两种蛋白胨理化指标检测结果均符合《中国生物制品主要原辅材料质控标准》规定,酸碱度、含氮量、氨基氮、干燥失重和炽灼残渣之间差异无统计学意义(P＞0.05),鱼蛋白胨FZU01相对分子质量主要分布在1 000以内,占92.5％,鱼粉蛋白胨相对分子质量主要分布在10 000,小于1 000占56.1％;与鱼粉蛋白胨组相比,鱼蛋白胨FZU01组生长速率明显增加(P＜0.05)。
随着组胺浓度的增加,大肠埃希菌的生长抑制率逐渐增加,与组胺浓度呈正相关,IC50为257.3 mg/L,当组胺浓度大于600 mg/L时,完全抑制大肠埃希菌的生长;大肠埃希菌的生长抑制率与重金属离子浓度呈正相关,Hg2+、Cd2+、As3+、Cr6+和pb2+对大肠埃希菌的IC50分别为1.35、4.67、7.37、11.04和20.19 mg/L。
应用[4][5]
鱼粉蛋白胨可以用于地衣芽孢杆菌BF-002高产芽孢的氮源流加工艺研究
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种需氧革兰氏阳性(G+)菌,广泛分布于自然界,尤其土壤中。地衣芽孢杆菌具有强抗逆性、酶种类丰富且表达能力强、抑菌、安全无毒害等特性,使其成为工业生产菌株较理想的选择。地衣芽孢杆菌可以形成芽孢,这些芽孢能够抵御极端环境,具有极强的生存能力,在制剂、存储和运输过程中不易死亡。产品中芽孢数量对地衣芽孢杆菌制剂的质量起到决定性的作用。
以一株产芽孢能力较弱的功能性地衣芽孢杆菌BF-002为研究对象,探索氮源对芽孢产生的影响,目的在于提高BF-002的芽孢产量,实现氮源流加过程的自动化控制,降低生产成本,为BF-002和其他种类芽孢杆菌菌剂的生产和应用提供工艺技术的支持。
主要研究结果如下:(1)在250 mL摇瓶中测定地衣芽孢杆菌BF-002的生长曲线,确定BF-002菌株种子液培养的培养时间为18 h,发酵培养的收获时间为21 h。通过摇瓶单因素实验优化发酵培养的温度、初始pH、碳源种类和氮源种类。确定的培养基和培养条件组合为:温度37℃、初始pH 7.0、碳源选用葡萄糖,氮源选用鱼粉蛋白胨和豆粕(鱼粉蛋白胨:豆粕=1:1)。
(2)在250 mL摇瓶实验中发现:初始氮源浓度越高,芽孢率越低;5 L发酵罐培养中却得出相反的结论:初始氮源浓度越高,芽孢率越高。深入分析发现,影响芽孢率的关键因素是单位活细胞所占有的氮源浓度。提出相对氨基氮浓度的概念:相对氨基氮浓度=氨基氮浓度÷OD600。无论在摇瓶还是发酵罐中,均存在“相对氨基氮浓度越低,芽孢率越高”规律。
(3)在5 L发酵罐中采用2.50 g·h-1、4.36 g·h-1和5.83 g·h-1三个速率进行恒速补料,结果表明最低的补料速率(2.50 g·h-1)能够获得最高的芽孢率(26.33%)。利用三种人工操作的反馈流加策略,即基于氨基氮离线测量的间歇补料、基于尾气CO2浓度的间歇补料和连续流加,控制相对氮源浓度。结果表明,采用基于尾气CO2浓度氮源连续流加策略,能将相对氨基氮能控制在8.42 mg·OD-1600水平,芽孢量和芽孢率最高,分别为6.12×109 cfu·mL-1和42.5%。
(4)采用python语言编写计算机控制程序,实现基于尾气CO2浓度反馈连续流加策略的自动化控制。同时,为了降低成本,将流加所用氮源由鱼粉蛋白胨替换成NH4Cl。利用该控制程序,在5 L和50 L的发酵罐中进行发酵实验。5 L规模下的芽孢量和芽孢率分别达到1.19×1010 cfu·mL-1和63.5%,50 L规模下的芽孢量和芽孢率分别为2.09×1010cfu·mL-1和73.2%,均明显高于上述人工操作条件下的水平。衡算所有5 L规模下发酵批次的经济效益,自动控制策略下的单位芽孢量原料成本为￥1.72·(1014cfu)-1,与采用人工操作方式的批次相比,仍然降低75.04%。
参考文献
[1]Activation and thermal stabilization of a recombinantγ-glutamyltranspeptidase from Bacillus licheniformis ATCC 27811 by monovalent cations[J].Lin,Long Liu;Lu,Bo Yuan;Chi,Meng Chun;Huang,Yu Fen;Lin,Min Guan;Wang,Tzu Fan.Applied Microbiology and Biotechnology,2022(5-6)
[2]Effectiveness of Bacillus licheniformis-Fermented Products and Their Derived Antimicrobial Lipopeptides in Controlling Coccidiosis in Broilers[J].Yu YuHsiang;Wu ChiaMin;Chen WeiJung;Hua KuoFeng;Liu JeRuei;Cheng YeongHsiang.Animals,2021(12)
[3]The Combined Effect of Potential Probiotic Bacillus licheniformis MCC 2514 and Bifidobacterium breve NCIM 5671 Towards Anti-inflammatory Activity on HT-29 Cell Lines.[J].H S Rohith;Halami Prakash Motiram.Probiotics and antimicrobial proteins,2021
[4]Differential Multi-cellularity Is Required for the Adaptation for Bacillus licheniformis to Withstand Heavy Metals Toxicity[J].Channarayapatna-Ramesh Sunilkumar;Emmanuel Stephen-Victor;Kishore Babu Naripogu;J.Samanth Kumar;Bettadapura Rameshgowda Nuthan;K.M.Marulasiddaswamy;Kukkundoor Ramachandra Kini;Nagaraja Geetha.Indian Journal of Microbiology,2021(4)
[5]许慧.地衣芽孢杆菌BF-002高产芽孢的氮源流加工艺研究[D].江南大学,2022.