背景[1]
尿嘧啶DNA糖基化酶 (UDG) 是一种关键的DNA修复酶, 有助于保持基因组的完整性.UDG特异性移除DNA中的尿嘧啶 (U) 碱基, 产生无嘌呤/无嘧啶 (AP) 位点用于下游的修复过程.UDG活性的异常能导致修复过程紊乱和基因突变, 最终导致相关疾病, 包括淋巴瘤、布卢姆综合症和人类免疫缺陷病.因此, 检测UDG活性是一种候选工具用于生物医学研究和疾病预后.
活性检测的常用策略[2]
检测UDG活性的常用策略包括凝胶策略、电化学策略和比色策略.与这些策略相比, 荧光策略由于具有安全、简单和灵敏的优点而受到关注.检测UDG活性的荧光策略一般是基于含多个U碱基的DNA探针.
当UDG移除DNA探针中的多个U碱基时, DNA探针的构型将会发生变化, 进而将对目标物UDG的识别事件转换成输出信号.尽管这些策略已经实现了良好的性能, 但是仍然存在一些不足影响它们在检测低活性UDG中的应用.由于每个DNA探针中的多个U碱基不能被低活性的UDG同时移除, 使得DNA探针的构型不能发生彻底的改变, 从而导致低效率的信号转导.因此, 期望发展一种信号转导效率高的新型荧光策略用于UDG活性的检测.
连接酶反应是指在连接DNA双链中的单链缺口时, DNA连接酶只能在缺口两侧碱基对完全匹配时, 才能将其特异性地连接[3].而当缺口3’侧存在碱基错配时, 连接酶反应将被抑制.这里, 发展了一种连接酶反应介导的荧光策略用于高效检测UDG活性.
首先, 两条短寡核苷酸链分别与发夹探针环部序列的一半进行杂交, 形成含缺口的DNA复合物.此时, 这两条短寡核苷酸链的刚性不足以打开发夹探针.
然后, 在UDG的作用下, 发夹探针环部的单个U碱基被移除并产生AP位点.其中, AP位点也是一种类型的碱基错配.相应地, 位于缺口3’侧的AP位点能抑制连接酶反应, 使得位于发夹探针末端的立足点和链迁移区域仍保持彼此邻近的状态.随后, 邻近的立足点和链迁移区域能够引发杂交链式反应 (HCR) 反应, 产生大量的G四倍体 (G4) 结构.
最后, G4结构能与N甲基卟啉IX (NMM) 相互作用, 产生增强的荧光信号.当UDG不存在时, 连接酶反应能将缺口两侧短寡核苷酸链连接成一条刚性增强的长DNA链, 进而将发夹探针打开, 使得位于发夹探针末端的立足点和链迁移区域彼此分离, 不能引发随后的HCR反应.本策略对UDG活性的检测限低至0.00020U/mL, 并能将UDG与其它DNA糖基化酶很好地区分开来.此外, 本策略也能用于检测HeLa细胞裂解液中的UDG活性, 并且细胞中其它组分对本策略造成的干扰很小.
切除DNA序列中不应存在的尿嘧啶[4]
此检测方法的原理是利用UDG酶切除双链DNA ON1-ON2中具有尿嘧啶的ON2，释放出富含G碱基的ON1。随后，ON1折叠形成G-四链体，与卢宇靖课题组合成的高选择性荧光探针DID-VP结合，产生荧光。即通过荧光强度与UDG浓度形成，达到对UDG线性检测的目的。
参考文献
[1] 连接酶反应介导的荧光策略用于高效检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的活性.吴玉姝 吴敏 刘敏.聊城大学生物制药研究院 聊城市人民医院
[2] Souza-Pinto N C, Harris C C, Bohr V A.p53functions in the incorporation step in DNA base excision repair in mouse liver mitochondria[J].Oncogene, 2004, 23:6559-6568.
[3] Wabuyele M B, Farquar H, Stryjewski W, et al.Approaching real-time molecular diagnostics:single-pair fluorescence resonance energy transfer (spFRET) detection for the analysis of low abundant point mutations in K-ras oncogenes[J].J Am Chem Soc, 2003, 125:6937-6945.
[4] Sensitive and selective detection of uracil-DNA glycosylase activity with a new pyridinium luminescent switch-on molecular probe.