背景[1-3]
人结肠癌细胞源自原位直肠腺癌，人结肠癌细胞和SW620细胞源自同一病人一年后的淋巴结转移。CSAp和直肠抗体3阴性；角蛋白免疫过氧化物酶染色阳性。p53基因第273位密码子的G→A突变引起Arg→His替代，309位密码子的C→T突变导致Pro→Ser替代。人结肠癌细胞p53蛋白表达水平提高，癌基因c-myc、K-ras、H-ras、N-ras、myb、sis和fos的表达呈阳性，癌基因N-myc的表达未做检测。人结肠癌细胞不表达细胞溶解酶，一种与肿瘤入侵相关的金属蛋白酶。有报道称，人结肠癌细胞表达GM-CSF。人结肠癌细胞ras原癌基因的12位密码子有一个突变，可以用作PCR法检测该突变的阳性对照。
人结肠癌细胞
人结肠癌细胞接受后处理
1)收到人结肠癌细胞后，请检查是否漏液。
2)请先在显微镜下确认人结肠癌细胞生长状态，去掉封口膜并将T25瓶置于37℃培养约2-3h。
3)弃去T25瓶中的培养基，添加6ml完全培养基。
4)如果人结肠癌细胞密度达80%-90%请及时进行细胞传代，传代培养用6ml人结肠癌细胞完全培养基。
5)接到细胞次日，请检查细胞是否污染。
人结肠癌细胞培养操作
1）复苏人结肠癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）人结肠癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）人结肠癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1.人结肠癌细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
人结肠癌细胞可以用于放线菌素V诱导人结肠癌细胞凋亡的机理研究
对比放线菌素D与放线菌素V在人结肠癌细胞中的体外抑增殖作用,发现其作用比放线菌素D更强。从而我们以放线菌素V为研究对象,使用人结肠癌细胞去探究其作用及机制,希望为放线菌素V的结肠癌临床治疗方面提供更多前期研究资料,主要研究结果如下:
1. 放线菌素V在体外抑制结肠癌细胞生长通过MTT法,使用放线菌素V和放线菌素D分别处理结肠癌细胞24、48及72h,随着浓度和作用时间的增加,存活的细胞减少,呈明显的浓度及时间依赖性。测得放线菌素V对结肠癌细胞HCT-116细胞的半数致死浓度(IC50)为2.85±0.10 nmol/L,对SW620的IC50为6.43±0.16 nmol/L,并且其对人正常肝肾细胞的毒性小于放线菌素D,可以继续研究其作为放线菌素D替代品的潜在可能性。
2. 放线菌素V诱导结肠癌细胞发生凋亡放线菌素V可以抑制结肠癌细胞生长,且对细胞的抑制作用体现在其可以诱导细胞凋亡。通过流式细胞术对处理组细胞进行检测分析,可以得出:加药后,细胞出现凋亡,且随着加药浓度的增加,出现凋亡的细胞越多,且大多集中在早期凋亡阶段。DAPI染色后用荧光显微镜观察,发现用药细胞中细胞核皱缩,出现凋亡小体,进一步使用蛋白质免疫印迹法确定在用药细胞中凋亡蛋白Bax/Bcl-2的比值上升,在微观蛋白层面上证明用药细胞发生凋亡。
3. 放线菌素V通过线粒体途径及PI3K/Akt途径诱导结肠癌细胞凋亡放线菌素V在结肠癌HCT-116细胞中引起线粒体膜电势降低,JC-1染色及流式细胞分析可以确定用药细胞线粒体膜电势发生明显降低,提示出现线粒体损伤。蛋白免疫印迹法检测用药细胞线粒体中的细胞色素C增加,且诱导caspase蛋白的级联反应,cleaved caspase-9增加,最后导致凋亡效应蛋白cleaved caspase-3增加并执行凋亡。
另外,放线菌素V也抑制PI3K-AKT蛋白通路相关蛋白的表达,使用免疫荧光染色确定P-Akt在细胞中的分布减少,蛋白质免疫印迹法进一步发现PI3K,P-Akt/Akt蛋白表达量减少。我们还采用了分子对接模型及HTRF等测试验证了放线菌素V对PI3K蛋白的亲和性。结果表明,放线菌素V诱导人结肠癌细胞HCT-116细胞凋亡与线粒体凋亡及PI3K-AKT通路密切相关,且其与PI3K蛋白有靶向结合倾向。
参考文献
[1]Discovery of actinomycin L,a new member of the actinomycin family of antibiotics[J].Machushynets Nataliia V.;Elsayed Somayah S.;Du Chao;Siegler Maxime A.;de la Cruz Mercedes;Genilloud Olga;Hankemeier Thomas;van Wezel Gilles P..Scientific Reports,2022(1)
[2]Apoptosis regulation at the mitochondria membrane level.[J].Dadsena Shashank;King Louise E;GarcíaSáez Ana J.Biochimica et biophysica acta.Biomembranes,2021(12)
[3]Molecular mechanisms of cell death in neurological diseases.[J].Moujalled Diane;Strasser Andreas;Liddell Jeffrey R.Cell death and differentiation,2021(7)
[4]Mechanisms of mitochondrial cell death[J].Dadsena Shashank;Zollo Cristiana;García-Sáez Ana J..Biochemical Society Transactions,2021(2)
[5]蒋诗清.放线菌素V诱导人结肠癌细胞凋亡的机理研究[D].山东大学,2022.