背景[1-3]
人膀胱癌细胞源于一位68岁的患有膀胱癌的白人男性患者。据报道，该细胞能产生SCF、IL-1、IL-3、IL-6、G-CSF、GM-CSF等。
人膀胱癌细胞
人膀胱癌细胞培养操作
1）复苏人膀胱癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）人膀胱癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）人膀胱癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1.人膀胱癌细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
人膀胱癌细胞可以用于人工合成的环状RNA元件通过靶向MicroRNA-183簇和转录因子β-catenin抑制膀胱癌细胞5637的恶性表型的研究
研究表明转录因子β-catenin和mi RNA-183簇可以对肿瘤的发生发展起到调控作用,先前有研究构建了一种人工长链非编码RNA可以实现对转录因子β-catenin和mi RNA-183簇的同时调控。然而,线性的非编码RNA在细胞内不稳定,我们想构建出一种能够同时调控转录因子和mi RNA的更稳定的合成生物学元件。而环状RNA既符合稳定的特点,又具有作为mi RNA分子海绵和适配体的功能。
此外,体外合成环状RNA技术已趋于成熟。因此,目标是构建一种合成生物学元件,其可以在细胞内形成环状RNA,并且形成的环状RNA序列是人工设计的目标序列。称这一元件为acirc RNA,其可以在肿瘤细胞内靶向转录因子β-catenin和mi RNA-183簇,从而实现对肿瘤细胞的调控。
方法:为了实现环状RNA元件的功能,利用合成生物学原理,将两个β-catenin的适配体c DNA序列和4个mi RNA-183-182-96簇配对位点c DNA序列串联排列,并将其插入环状RNA人工过表达载体的填充序列中,从而构建出我们所需的acirc RNA。将acirc RNA元件转染至膀胱癌5637细胞中,通过荧光定量PCR、CCK-8、Edu、流式细胞术等功能实验验证该元件对5637细胞中靶分子的调控作用及表型的影响。
此外,构建了四个质粒用于验证该元件是否能够在细胞内成环。结果:将验证成环所构建的四个质粒转入到293t细胞中,各组细胞荧光表达情况与预期推断结果一致,表明我们构建的环状RNA元件能够在细胞内形成环状RNA。PCR结果显示该环状RNA元件能够降低mi RNA-183-182-96簇和β-catenin的表达。
进一步的功能实验表明,该环状RNA元件能够影响5637细胞的增殖、迁移、和凋亡。
结论:合成的环状RNA元件能够在细胞内形成特定的环状RNA分子并发挥抑制肿瘤细胞表型的作用,且在膀胱癌细胞5637中实现了转录前和转录后的同时调控。然而更进一步的研究仍需要完善,将其运用到肿瘤的治疗中仍存在一定的距离。
参考文献
[1]Global Cancer Statistics 2020:GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries[J].Sung Hyuna;Ferlay Jacques;Siegel Rebecca L.;Laversanne Mathieu;Soerjomataram Isabelle;Jemal Ahmedin;Bray Freddie.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2021(3)
[2]Synthetic circular multi-miR sponge simultaneously inhibits miR-21 and miR-93 in esophageal carcinoma.[J].Wang Zhe;;Ma Ke;;Cheng Yulan;;Abraham John M;;Liu Xi;;Ke Xiquan;;Wang Zhirong;;Meltzer Stephen J.Laboratory investigation;a journal of technical methods and pathology,2019(10)
[3]Past,present,and future of circRNAs.[J].Patop Ines Lucia;;Wüst Stas;;Kadener Sebastian.The EMBO journal,2019(16)
[4]Highly efficient expression of circular RNA aptamers in cells using autocatalytic transcripts.[J].Litke Jacob L;;Jaffrey Samie R.Nature biotechnology,2019(6)
[5]胡坤.人工合成的环状RNA元件通过靶向MicroRNA-183簇和转录因子β-catenin抑制膀胱癌细胞5637的恶性表型的研究[D].安徽医科大学,2021.