背景[1-3]
RL95-2细胞来源于65岁白人女性子宫内膜腺鳞癌。RL95-2细胞有α角蛋白，清晰的连接复合体，张力丝和表面微绒毛，雌激素受体阳性。RL95-2细胞可以用于3D细胞培养和癌症研究。
RL95-2
RL95-2细胞培养步骤：
1）复苏RL95-2细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）RL95-2细胞传代：如果RL95-2细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察RL95-2细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。
3.轻轻吹打RL95-2细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
3）RL95-2细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。
应用[4][5]
RL95-2可以用于KLK4在子宫内膜腺癌中的表达和对RL95-2细胞侵袭的影响研究
从KLK4在子宫内膜癌中的表达和临床病理参数及预后之间的关系,对子宫内膜癌细胞功能的影响及可能的机制等几个层面做了探讨。部分KLK4在子宫内膜癌中的表达及临床意义目的探讨KLK4在子宫内膜癌中的表达及临床意义,为改善子宫内膜癌的预后提供新的思路。
方法：免疫组化法检测81例子宫内膜癌、30例不典型增生的子宫内膜和30例正常子宫内膜中KLK4的表达情况,收集患者临床病理资料,结合随访资料做生存分析,得出KLK4的表达和子宫内膜癌预后的关系。结果KLK4主要定位在细胞核,在正常内膜、不典型增生内膜和子宫内膜癌中的高表达率分别为30%、53%、67%,差异有统计学意义(P=0.002);KLK4的高表达和子宫内膜癌的分化程度及深肌层浸润相关(P=0.021,P=0.031),与年龄、临床分期、淋巴结转移无关;KLK4高表达组的5年无进展生存率较低表达组更低,差异有统计学意义(P=0.032)。
结论：KLK4的高表达可能与子宫内膜癌细胞的分化程度和局部侵袭有关,高表达提示早期复发,有可能作为预测子宫内膜癌早期复发的标志物。
第二部分KLK4在子宫内膜癌细胞中的表达和雌激素对KLK4的调节作用目的探讨KLK4在子宫内膜癌细胞中的表达情况及雌激素对KLK4表达的影响方法Real-time PCR及Western blot检测KLK4 m RNA及蛋白在Ishikawa、HEC-1B及RL95-2细胞中的表达。用不含雌激素的培养基培养Ishkawa细胞,分别加入10-10mol/L、10-8mol/L及10-6mol/L的17-β雌二醇培养,分别在24h、48h、72h检测KLK4 m RNA及蛋白的表达量。再以作用浓度的雌激素联合10-9mol/L、10-7mol/L及10-5mol/L的雌激素受体拮抗剂ICI182,780作用于Ishkawa细胞,观察雌激素受体拮抗剂对KLK4表达的影响。
结果：KLK4在子宫内膜癌细胞中的表达强度由高到低依次为HEC-1B、Ishikawa、RL95-2。雌激素能促进Ishkawa细胞中KLK4的表达,以10-8mol/L作用48h最明显。ICI182,780能阻断雌激素对KLK4表达的上调作用,当浓度为10-7mol/L时阻断效果最明显。结论雌激素能够上调子宫内膜癌细胞中KLK4的表达,雌激素受体拮抗剂能阻断雌激素对KLK4表达的上调作用。推测雌激素能够通过雌激素受体促进子宫内膜癌细胞中KLK4的表达。
第三部分过表达KLK4对子宫内膜癌细胞功能的影响目的探讨KLK4在子宫内膜癌细胞中可能存在的作用。方法以pc DNA3.1(+)为载体构建KLK4过表达质粒,转染至KLK4低表达的RL95-2细胞,通过G418连续筛选获得稳定过表达KLK4的RL95-2细胞。MTT法检测过表达KLK4对RL95-2细胞增殖的影响,划痕实验及transwell侵袭实验检测过表达KLK4对RL95-2细胞体外迁移及侵袭能力的影响。结果成功构建KLK4的过表达质粒并建立稳定过表达KLK4的细胞系。MTT实验显示过表达KLK4不能促进RL95-2细胞的增殖,但划痕实验及transwell侵袭实验显示其体外迁移和侵袭能力较对照组明显增加。结论KLK4过表达能促进RL95-2细胞的体外迁移及侵袭能力,但不能促进其增殖。
参考文献
[1]Corrigendum to“Endometrial cancer:A review and current management strategies:Part I”[Gynecol Oncol 134(2014)385–392].William M.Burke;;James Orr;;Mario Leitao;;Emery Salom;;Paola Gehrig;;Alexander B.Olawaiye;;Molly Brewer;;Dave Boruta;;Jeannine Villella;;Tom Herzog;;Fadi Abu Shahin.Gynecologic Oncology,2014
[2]Rapid Estrogen Signaling Negatively Regulates PTEN Activity Through Phosphorylation in Endometrial Cancer Cells.Melanie M.Scully;;Leslie K.Palacios-Helgeson;;Lah S.Wah;;Twila A.Jackson.Hormones and Cancer,2014
[3]Function and clinical relevance of kallikrein-related peptidases and other serine proteases in gynecological cancers.Julia Dorn;;Nathalie Beaufort;;Manfred Schmitt;;Eleftherios P.Diamandis;;Peter Goettig;;Viktor Magdolen.Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences,2014
[4]miR?20a is an independent prognostic factor in colorectal cancer andis involved in cell metastasis.Guang?Jun Zhang;;Yu Li;;He Zhou;;Hua?Xu Xiao;;Tong Zhou.Molecular Medicine Reports,2014
[5]张千峰.KLK4在子宫内膜腺癌中的表达和对RL95-2细胞侵袭的影响研究[D].第四军医大学,2015.