背景[1-3]
Detroit 562是从一名白人女性咽癌患者的咽中分离出来的。Detroit 562细胞角蛋白免疫过氧化物酶染色阳性，对人类脊髓灰质炎病毒1、水泡性口炎病毒易感。Detroit 562细胞可以用于3D细胞培养、癌症研究。
Detroit 562
Detroit 562培养操作:
1）复苏Detroit 562细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）Detroit 562细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）Detroit 562细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
Detroit 562可以用于Hsa-miR-7-5p在头颈部鳞状细胞癌中的生物学功能与临床意义研究
随着人们对microRNA的深入研究发现,异常升高或降低的microRNA与恶性肿瘤的增殖、侵袭、转移和放化疗抵抗等表型不仅有着密切联系,还发挥着重要的生物学调控功能。
研究旨在阐明hsa-miR-7-5p在头颈部鳞状细胞癌中的生物学功能。
方法:在TCGA数据库中分析相关数据得到hsa-miR-7-5p在头颈部鳞状细胞癌中的表达量,在Kaplan-Meier Plotter作出差异表达hsa-miR-7-5p患者的生存曲线图。
通过qPCR检测Hsa-miR-7-5p在头颈部鳞状细胞癌中的表达量;通过转染hsa-miR-7-5p的mimic和inhibitor来过表达或敲降hsa-miR-7-5p后,用cck8,克隆形成,Transwell(侵袭和迁移)、流式细胞术检测周期和凋亡来验证Hsa-miR-7-5p在头颈部鳞状细胞癌中的功能。结果:Hsa-miR-7-5p在头颈部鳞状细胞癌组织和细胞系中表达上调,特别是在喉鳞癌中该分子与患者预后呈负相关。
通过体外细胞实验表明:在CAL-27、Fa Du、Detroit 562、AMC-HN-8和FD-LSC-1细胞中过表达hsa-miR-7-5p后,可以增强头颈部鳞状细胞癌增殖能力与平板克隆能力。在CAL-27、Fa Du、Detroit 562和FD-LSC-1细胞中过表达hsa-miR-7-5p后,侵袭和迁移能力明显增强;相反,抑制hsa-miR-7-5p的表达则可以抑制肿瘤细胞增殖、平板克隆、侵袭和迁移能力。
但体外改变hsa-miR-7-5p的表达对于头颈部鳞状细胞癌的周期和凋亡的影响无统计学差异。
结论:Hsa-miR-7-5p在头颈部鳞状细胞癌中高表达,能促进头颈部鳞状细胞癌细胞的增殖,侵袭及迁移等能力,在肿瘤的发生发展中发挥促进作用。因此hsa-miR-7-5p在头颈部鳞状细胞癌中可能具有潜在癌基因作用,可以作为头颈部鳞状细胞癌一个潜在的治疗靶点和预后标志物。
参考文献
[1]Upregulated miR‑411‑5p levels promote lymph node metastasis by targeting RYBP in head and neck squamous cell carcinoma.Zhang Chi;Wang Hongfei;Deng Miao;He Lihong;Ping Fan;He Yuan;Fan Zhaona;Cheng Bin;Xia Juan.International Journal of Molecular Medicine,2021
[2]Downregulation of miR-7-5p Inhibits the Tumorigenesis of Esophagus Cancer via Targeting KLF4..Woda Shi;Jianxiang Song;Zhengya Gao;Xingchen Liu;Wencai Wang.OncoTargets and therapy,2020
[3]CDK19 as a Potential HPV-Independent Biomarker for Recurrent Disease in HNSCC.Finn-Ole Paulsen;;Christian Idel;;Julika Ribbat-Idel;;Patrick Kuppler;;Luise Klapper;;Dirk Rades;;Karl-Ludwig Bruchhage;;Barbara Wollenberg;;Johannes Brägelmann;;Sven Perner;;Anne Offermann.International Journal of Molecular Sciences,2020
[4]Immune Checkpoint Expression on Immune Cells of HNSCC Patients and Modulation by Chemo-and Immunotherapy.Lisa K.Puntigam;;Sandra S.Jeske;;Marlies Götz;;Jochen Greiner;;Simon Laban;;Marie-Nicole Theodoraki;;Johannes Doescher;;Stephanie E.Weissinger;;Cornelia Brunner;;Thomas K.Hoffmann;;Patrick J.Schuler.International Journal of Molecular Sciences,2020
[5]代力.Hsa-miR-7-5p在头颈部鳞状细胞癌中的生物学功能与临床意义研究[D].山西医科大学,2021.