背景[1-3]
血管内皮细胞本身为人脐静脉内皮细胞，可用于脐静脉内皮损伤修复的研究，但是经检测证明，ECV-304细胞已经被膀胱癌细胞污染；ECV-304细胞具有T24细胞特性。
血管内皮细胞
血管内皮细胞培养步骤：
一．血管内皮细胞培养基及培养冻存条件准备：
1)准备：DMEM+10%FBS+1%P/S
2)培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3)冻存液：50%basal medium+40%FBS+10%DMSO。
二．血管内皮细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
注：次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。
3）血管内皮细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。明舟生物（mingzhoubio）按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。
3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
血管内皮细胞可以用于晚期氧化蛋白产物对人血管内皮细胞基质细胞衍生因子1α表达及信号转导通路的研究
探讨AOPP对人血管内皮细胞与单核细胞粘附的影响,对SDF-1α趋化单核细胞的作用,以及对人血管内皮细胞SDF-1αmRNA表达及蛋白合成的影响,同时探讨这一作用是否通过MAPK径路转导,最后从临床角度观察2型糖尿病患者血浆AOPP水平及其与心血管危险因素的关系。
方法:一、ECV304细胞株及THP-1细胞株的培养两种细胞均常规培养于37℃,5%CO2湿润的恒温孵箱中。培养液为含有10%胎牛血清的RPMI1640。取第3-5代用于实验,以台盼蓝染色法检测细胞死亡率,各组细胞死亡率均≤5%。
二、AOPP-BSA的制备200mg/ml BSA与0.2mol/L NaOCl各取等量混合(即以1:60摩尔比混合),室温孵育30分钟,4℃以0.01mol/L PBS(pH 7.4)透析24小时,0.22μm硝酸纤维素膜过滤消毒,-70℃冻存。以经同样处理但未加NaOCl的BSA作对照。酸性条件340nm测AOPP-BSA浓度,以氯胺-T为标准品,实际测定的为AOPP对氯胺-T的相对浓度。
三、THP-1/ECV304细胞粘附实验将ECV304细胞接种于6孔板,加入不同浓度AOPP,之后再加入THP-1细胞37℃孵育30分钟,倒置显微镜下计数每个视野粘附的THP-1细胞数。
四、SDF-1α趋化THP-1细胞实验单核细胞迁移用8μM孔径的Transwell小室来分析。不同浓度AOPP预处理24小时的THP-1细胞加到上室,下室加入不同浓度的SDF-1α,37℃孵育10小时后取出上室,在300×显微镜下连续计数4个视野的细胞数,取其平均值。
五、SDF-1αmRNA的测定ECV304细胞分别与细胞培养基、200μmol/l BSA、50、100、200μmol/l AOPP-BSA共同孵育6小时,或者与200μmol/l AOPP-BSA共同孵育0、2、6、12、24小时后,收集细胞,加入Trizol试剂提取细胞总RNA。RT-PCR法测定SDF-1αmRNA的表达。
六、SDF-1α蛋白的测定ECV304细胞分别与细胞培养基、200μmol/l BSA、50、100、200μmol/l AOPP-BSA共同孵育12小时,或者与200μmol/l AOPP-BSA共同孵育0、2、6、12、24小时后,收集细胞,提取细胞总蛋白。Western-blot法测定SDF-1α蛋白的表达。阻断实验中先以不同浓度的p38MAPK特异性阻断剂SB203580或者ERK1/2特异性阻断剂U0126与ECV304孵育1小时,然后与200μmol/l AOPP-BSA共同孵育12小时,ELISA法测定上清液中SDF-1α蛋白浓度。
七、p-p38MAPK及p-ERK1/2蛋白的测定ECV304细胞分别与细胞培养基、200μmol/l BSA、50、100、200μmol/l AOPP-BSA共同孵育15分钟,或者与200μmol/l AOPP-BSA共同孵育0、15、30、60、120分钟后,收集细胞,提取细胞总蛋白。Western-blot法测定p-p38MAPK及p-ERK1/2蛋白的表达。
八、2型糖尿病患者血清SDF-1α及AOPP浓度测定清晨空腹抽取静脉血5ml加入含10%EDTA的抗凝管中,离心取上清。SDF-1α浓度采用酶联免疫吸附法,按照说明书进行,用荧光免疫分析仪检测每孔在450nm处的吸光度。AOPP浓度应用分光光度法测定,血清与PBS按1∶5稀释,以氯胺-T同法稀释作空白对照,加入1.16 mmol/L KI 10μl及乙酸20μl后立刻测340 nm处的吸收度值。
结果:一、AOPP呈剂量依赖性的方式促进THP-1细胞与ECV304细胞的粘附未经AOPP处理时粘附于ECV304的THP-1细胞甚少,50μmol/l的AOPP就可使粘附的THP-1细胞数目明显增加,以200μmol/l的AOPP组所粘附的细胞数目最多,与对照组相比较增加了约26倍。
二、AOPP呈剂量依赖性的方式增强SDF-1α对THP-1细胞的趋化作用将不同浓度AOPP处理24小时后的THP-1细胞用10ng/ml SDF-1α进行趋化。随着AOPP浓度的增加,被趋化的细胞数也逐渐增加,200μmol/l AOPP组所趋化的细胞数是对照组的11倍。
三、AOPP呈时间和剂量依赖的方式促进ECV304细胞SDF-1αmRNA表达增加与200μmol/L AOPP-BSA孵育2小时后ECV304细胞SDF-1αmRNA表达量较对照组既显著增加,6小时达高峰,之后逐渐下降,24小时SDF-1αmRNA表达量与对照组比较无显著差异。与50μmol/l,100μmol/l,200μmol/L AOPP-BSA孵育6小时后ECV304细胞SDF-1αmRNA表达量依次升高,与对照组相比差异有统计学意义。200μmol/L BSA孵育或者未加处理因素者也有SDF-1αmRNA的表达,两组间无差异。
参考文献
[1]Comparative assessment of urinary oxidative indices in breast and colorectal cancer patients.S.Chandramathi;;K.Suresh;;Z.B.Anita;;U.R.Kuppusamy.Journal of Cancer Research and Clinical Oncology,2009
[2]Advanced oxidation protein products are increased in women with polycystic ovary syndrome:relationship to traditional and non-traditional cardiovascular risk factors.C.Kaya;;A.F.Erkan;;B.Berker;;A.Bilgihan;;S.D.Cengiz.Fertility and Sterility,2008
[3]AOPP and its relations with selected markers of oxidative/antioxidative system in type 2 diabetes mellitus.Agnieszka Piwowar;;Maria Knapik-Kordecka;;Maria Warwas.Diabetes Research and Clinical Practice,2007
[4]Oxidative stress in childhood type 1 diabetes:Results from a study covering the first 20 years of evolution.Pilar Martín-Gallán;;Antonio Carrascosa;;Miguel Gussinyé;;Carmen Domínguez.Free Radical Research.2007
[5]史春虹.晚期氧化蛋白产物对人血管内皮细胞基质细胞衍生因子1α表达及信号转导通路的研究[D].大连医科大学,2010.