背景[1-3]
羊巴贝斯虫PCR试剂盒是利用pcr技术来检测含有羊巴贝斯虫的样本，羊巴贝斯虫PCR试剂盒参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+，引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
羊巴贝斯虫
羊巴贝斯虫PCR试剂盒具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
3.产品精心优化且特异性高，引物是根据高度保守区设计，不会跟除此之外的其它微生物DNA发生交叉反应。
4.PCR mix中含上样染料，PCR后可以直接上样电泳。
5.本产品足够50次20μL体系的PCR反应。
6. 本产品只能用于定性实验，不能用于定量。
羊巴贝斯虫PCR试剂盒样品的制备
1.如果有N个样品，必须设置N+2个提取反应，多出的两个中一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL牛乳头瘤病毒PCR阳性对照（1×10E6拷贝/μL，本试剂盒提供）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。
2.用自选方法纯化上述N+2个样品的DNA。本试剂盒跟市场上大多数细菌DNA提取试剂盒兼容。
羊巴贝斯虫PCR试剂盒电泳分析
1.取5-10uL扩增产物进行常规琼脂糖电泳，检测扩增效果，由于扩增产物较短，建议用1.5%-2.0%的琼脂糖凝胶。
2.阳性样品预期得到的扩增产物长度为200bp左右。如果两个阴性对照（样品制备阴性对照或PCR阴性对照）有此扩增产物，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析实验结果。
3.如果所有样品和PCR阳性对照均无此扩增产物，则说明有系统性的问题（试剂、设备、程序、操作等），需要重复并排查原因。
4.如果没有上述两种情况，则实验有效，可以分析样品的扩增结果。N+2个样品中有扩增产物的判定为阳性，无则判定为阴性。
应用[4-5]
羊巴贝斯虫PCR试剂盒可以用于我国羊巴贝斯虫TRAP蛋白的分析及多重PCR方法的建立
羊巴贝斯虫病(Ovine babesiosis)是由媒介蜱传播的一种血液原虫病,患病动物临床表现发热、贫血、黄疸、血红蛋白尿等症状,严重感染时可引起死亡。
通过克隆我国分离的2种6株羊巴贝斯虫trap基因全长,分析其结构特征,并以其为靶基因对我国羊巴贝斯虫的分类关系进行分析;表达重组TRAP蛋白,测定其反应原性;建立羊巴贝斯虫PCR试剂盒多重PCR检测方法,并应用该方法对我国9省采集的羊血样进行检测。
目的是为了阐明羊巴贝斯虫trap基因结构,测定其作为免疫学和分子诊断靶标的可能性,同时为进一步确认我国羊巴贝斯虫的分类关系和该病在我国的流行状况提供基础数据。
现将研究内容总结如下:1.通过动物感染试验,获得6株羊巴贝斯虫的阳性血清、纯化的裂殖子、基因组DNA等标准样品。克隆其trap基因的全长序列,生物信息学分析其核苷酸和推导的氨基酸序列的结构特征;并以其为靶标分子,对我国羊巴贝斯虫的分类地位进行分析。
结果显示,我国分离的羊巴贝斯虫存在两个种,羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫;而莫氏巴贝斯虫内可以分为两个亚种,代表株分别为河北株/宁县株和临潭株/天祝株。该研究结果为开展巴贝斯虫trap基因的功能和厘清我国羊巴贝斯虫的分类关系提供了依据。
2. 以莫氏巴贝斯虫临潭株和羊巴贝斯虫未定种新疆株为研究对象,分别从其cDNA中成功扩增trap基因全长,构建原核表达载体p ET-30a-BLTtrap和pET-30a-BXJtrap,转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞,表达和纯化重组蛋白rBm TRAP和rBspTRAP,进行质谱鉴定和反应原性分析。
结果显示该基因在大肠杆菌中被正确表达,rBmTRAP和rBsp TRAP大小分别为130ku和110ku;纯化后的蛋白浓度分别达到125μg/m L和100μg/m L。Western-blot和ELISA试验结果均表明rBspTRAP与rBm TRAP具有良好的反应性和特异性,与其他羊梨形虫和无浆体无交叉反应;用ELISA测定实验感染羊的血清中抗TRAP蛋白抗体滴度的试验结果显示,感染后羊体内抗TRAP蛋白的抗体滴度较低。结果表明TRAP可能不适合作为靶标蛋白建立羊巴贝斯虫血清学检测方法,也可能是由于本研究并未筛选到ELISA反应条件导致,我们将在将来的研究中进行进一步确认。
3. 以6株羊巴贝斯虫trap基因为靶基因,设计合成三对特异性引物。通过羊巴贝斯虫PCR试剂盒条件优化,建立可用于检测羊巴贝斯虫未定种新疆株/敦煌株、莫氏巴贝斯虫临潭株/天祝株和莫氏巴贝斯虫宁县株/河北株三个(亚)种虫株混合感染的多重PCR检测方法。
该多重PCR方法与其他羊的巴贝斯虫、泰勒虫和无浆体无交叉反应,最低可检测到10-100pg的羊巴贝斯虫基因组DNA。以所建的多重PCR方法对实验室感染的样品和采自我国甘肃、新疆等9省份的976份野外样品进行检测,结果显示,羊巴贝斯虫未定种平均阳性率为0.82%,而莫氏巴贝斯虫的平均阳性率为1.02%。
参考文献
[1]Strong conservation of rhoptry-associated-protein-1(RAP-1)locus organization and sequence among Babesia isolates infecting sheep from China(Babesia motasi-like phylogenetic group).Qingli Niu;;Charlotte Valentin;;Claire Bonsergent;;Laurence Malandrin.Infection,Genetics and Evolution,2014
[2]A PCR method targeting internal transcribed spacers:the simultaneous detection of Babesia bigemina and Babesia bovis in cattle.Junlong Liu;;Guiquan Guan;;Aihong Liu;;Youquan Li;;Hong Yin;;Jianxun Luo.Acta Parasitologica,2014
[3]Cytochrome c oxidase subunit III(COX3)gene,an informative marker for phylogenetic analysis and differentiation of Babesia species in China.Zhancheng Tian;;Guangyuan Liu;;Hong Yin;;Jianxun Luo;;Guiquan Guan;;Junren Xie;;Jin Luo;;Jinfeng Zheng;;Meiyuan Tian;;Xiaosong Yuan;;Fangfang Wang;;Ronggui Chen;;Haijun Wang.Infection,Genetics and Evolution,2013
[4]Phylogenetic analysis based on 28S rRNA of Babesia spp.in ruminants in China.Huitian Gou;;Guiquan Guan;;Miling Ma;;Aihong Liu;;Zhijie Liu;;Qiaoyun Ren;;Youquan Li;;Jifei Yang;;Ze Chen;;Hong Yin;;Jianxun Luo.Experimental and Applied Acarology,2013
[5]何欣.我国羊巴贝斯虫TRAP蛋白的分析及多重PCR方法的建立[D].中国农业科学院,2018.